上涙腺の眼瞼部分への注射の実施:ウサギモデルにおけるドライアイ疾患誘発技術

要約

出典:Honkanen, R. A., et al.涙腺へのコンカナバリンA注射によって誘発される水性欠乏性ドライアイ疾患のウサギモデル:薬効研究への応用。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、上涙腺の眼瞼部分にコンカナバリンAを注射することにより、ウサギモデルで水性欠乏性ドライアイ疾患を誘発する手順を示しています。このモデルは、ドライアイ疾患を治療するための薬物動態および生体内分布アッセイに有用です。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物と住居

1. 体重2〜3 kgのニュージーランドホワイト(NZW)ウサギを入手します。
2. ウサギをケージに単独で収容し、温度(65±5°F)と湿度(45±5%)を厳密に制御します。照明には12時間のオン/オフサイクルが必要です。
3. 水と標準的なウサギのチャウへの無制限のアクセスを提供します。食事療法のエンリッチメントには、目に影響を与えるビタミンAが含まれている可能性があるため、排除してください。
4. ベースライン測定またはドライアイの誘発の少なくとも2週間前に動物を順応させます。

2. 麻酔と安楽死の方法

>注:中程度の鎮静が必要なCon A注射を除き、すべての処置で軽度の鎮静が必要です。

1. 軽度の鎮静には、アセプロマジン(1 mg / kg)を26ゲージの針を使用して肩に皮下注射します。.軽度の鎮静のエンドポイント:動物はリラックスした頭の位置を維持し、耳たぶは完全に直立しなくなりました.
   手記：適切なエンドポイントに達しない場合は、アセプロマジンの追加注射を行うことができます。.動物は常に目を覚まし、ひげに触れると反応し、呼吸が遅くならないようにする必要があります。
2. 中等度の鎮静のために、最初に上記のように動物にアセプロマジンを与えます。エンドポイントに到達したら(上記の注を参照)、O₂フローを1 L / minに設定し、イソフルランの送達を5%に設定したガスマスクを使用してイソフルランを投与します(図1)。.
3. ウサギの体調が完全にリラックスし、耳が完全にペラペラになるまでイソフルランを投与します
   手記：動物が横向きになったときには、代償性の筋肉の動きは起こらないはずです。呼吸は常に自発的なままです。
4. 自発的な回復は2〜5分以内に起こります:兆候には、自発的な頭の動きや筋肉の緊張の増加または正常な緊張が含まれます。実験手順が適度な鎮静で完了した後、ウサギを約30分間、または行動が正常に戻るまで観察します
   手記：眼科用軟膏は、どちらの鎮静剤でも必要ありません。.1)軽度の鎮静では、動物はまだ警戒しており、まばたき反射を維持します。中等度の鎮静では、まばたき反射の抑制は非常に短いため、眼の表面は危険にさらされません。.2) 眼科用軟膏を眼表面に配置すると、検査中に評価された構造の視覚化が妨げられます。
5. 安楽死:静脈内ペントバルビタール(100 mg / kg)の過剰摂取を使用してください。.

3. ドライアイの導入と治療

>注:眼窩涙腺系の3つの部分が注入されます。

1. ウサギをアセプロマジン0.2 mg / kgで皮下鎮静します。.
2. 眼窩周囲と頭皮の部分の毛皮を剪断し、Nairを使用して残っている毛皮を完全に取り除きます。解剖学的特徴とコンカナバリンAの米国誘導注射をよりよく視覚化するために、皮膚を完全に滑らかにします(図2)。
3. 上記のように中程度の鎮静を誘発します。.
4. 上涙腺の眼瞼部分の注射 (PSLG)
   手記：最初にPSLGの注入を行います。
   1. 防腐剤を含まないリドカイン1%をマイクロピペットで適切な眼に25μL塗布します。
   2. 上まぶたを削り、眼瞼の眼瞼部分を示す隆起が見えるまで、後眼窩縁に穏やかな内側圧力を加えます。PSLGは、上眼瞼の後部(側頭部)に小さな球状の隆起として現れます
      手記：学習プロセス中に腺組織を表示するには、その領域に5%フルオレセインを塗布します(図3A)。球根状のPSLGから涙が流れているのが見えます。フルオレセインの適用は、Con Aの投与には必要ありません。これは、腺組織を示すための説明のみを目的として行われます。
   3. 細い歯の鉗子とツベルクリン注射器に27ゲージの針を使用して、経結膜アプローチを使用して腺を直接貫通します。針を組織内に2mm進め、0.1mLの容量で500μgのConAを注入します(図3B).
      注:この注射は時々痛みを伴うことがあります。必要に応じて、この注射が完了するまで動物をイソフルランの下に保ちます。.

結果

図1:ガスマスクによる鎮静。この写真は、イソフルランによる短時間の中程度の鎮静を提供するガスマスクを示しています。

図2:コンカナバリンA注射用のウサギの調製。(A)小さな鋏を使用して毛皮を取り除き、眼窩上涙腺を識別するためのランドマークを簡単に視覚化できます。(B)ナイールは、剪断後に残った毛を取り除くために使用されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
27ゲージ針(5/8)	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー、ニュージャージー州フランクリン・レイクス	305921	涙腺にConAを注入するための針
アセプロイン(アセプロマジン)	ヘンリー・シャイン・アニマルヘルス、オハイオ州ダブリン	NDC11695-0079-8	ウサギの鎮静のための0.1ml / kg皮下注射
麻酔気化器	VetEquip、カリフォルニア州プレザントン	アイテム #911103
ビショップハーモン鉗子	ボシュロム(ストルツ)、ニュージャージー州ブリッジウォーター	E1500-Cの	組織鉗子
コンカナバリンA	シグマ、セントルイス、ミズーリ州	2010年頃	ウサギの涙腺への注射のためにPBSで5mg / mlを作ります
フルオレセイン	アクロン、レイクフォレスト、イリノイ州	NDC17478-253	PBSで0.2%に希釈してTBUTを測定します
イソフルラン	ヘンリー・シャイン、ニューヨーク州メルビル	29405
リドカイン	シグマ、セントルイス、ミズーリ州	L5647	麻酔剤のPBS中1%
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	Mediatech, Inc. バージニア州マナサス	21-031-履歴書
ウサギ、ニュージーランドホワイト、またはオランダのベルト付き(テキストに記載されているとおり)	Charles River Labs、マサチューセッツ州ウォルサム	2-3キロ	研究動物
サージカルルーペ +1.50	Designs for Vision、ボヘミア、ニューヨーク	特産品	涙液の分解を観察し、Concanavalin A注射を行いながら、眼表面の壮大さを提供します。