ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)単離:収穫されたブタ腹部大動脈から内皮細胞を単離するための酵素ベースの方法

要約

出典:Zhao, Y. et al. Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、ワンステップコラゲナーゼ消化法を用いて、ブタモデルの腹部大動脈から内皮細胞を単離する様子を実演しています。内皮細胞は、さらなるダウンストリームアプリケーションのために培養することができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ブタ大動脈内皮細胞の単離

1. 無菌条件下で、ブタ大動脈を洗浄バッファーから取り出し、150 mmのシャーレに置きます(図1A)。
2. 大動脈の両端をそっと切り取り、滅菌鉗子とはさみで大動脈周辺の余分な組織を再度切除します(図1B)。大動脈の外側と内側を(室温で培養皿の上)20-50mLの洗浄緩衝液で洗浄します:1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンを含む1xPBS溶液(pH 7.4)
   手記：一部のECが損傷したため、手術中にクランプが配置された領域のみを切断し、余分な組織と動脈の側枝を取り除くようにしてください。
3. 外科用縫合糸を大動脈に通し、外科用縫合糸を使用して大動脈の一端を結びます(5-0、90cm、資料表)。外科用縫合糸を大動脈の内側に保ちます(図1C、D)。
4. 結ばれた端の近くに大動脈を鉗子で静かに固定し、次に外科的縫合糸をゆっくりと引っ張って大動脈を逆転させ、大動脈の内皮表面が露出するまで(図1E−G).
   手記：結ばれた端の近くに大動脈を固定し、大動脈をしっかりと固定しないと、外科用縫合糸を引っ張って大動脈を元に戻すことはできません。
5. 大動脈の内皮表面を洗浄バッファー3回(洗浄あたり10mL)で洗浄し、この溶液を廃棄します。.大動脈を15 mLの遠心チューブに入れ、チューブ内の10 mLの0.005%コラゲナーゼIV消化液で大動脈を覆います(図1H).
   手記：0.005%コラゲナーゼIV消化液を37°Cで予温してから消化します。
6. 37°Cで15分間インキュベートし、消化した大動脈と消化液を100 mmの培養皿に入れ、10-15 mLの予冷停止バッファーを添加して0.005%コラゲナーゼIVの効果を停止します:Dulbeccoの改変イーグルス培地(DMEM)に10%熱不活化FBSと1%P/S.
   手記： 推奨される消化時間は10〜20分です。大動脈の内皮表面が停止バッファーで覆われていることを確認してください。
7. セルスクレーパーを使用して、大動脈の内面からpAECを静かに掻き取ります(図1I)。削り取った大動脈を洗浄バッファー(1回あたり5mL)で3回洗浄します。培養皿の溶液を50mLの遠心チューブに入れます。培養皿の底を洗浄バッファー(1回あたり5mL)で2回洗浄し、溶液を再び50mLの遠心チューブに入れます
   手記：一方向に静かにこすり、圧縮しないでください。端や穴の近くの組織に触れないでください。5−8xのスクレイピングをお勧めします。
8. チューブを600 x gで6分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨て、50 mLの遠心チューブの底に10 mLの溶液を残します。50 mLの遠心分離チューブに20 mLの洗浄バッファーを加え、ペレットを再懸濁します。このステップでは、気泡を避けてください。
9. 600 x gで4°Cで6分間遠心分離し、上清をゆっくりと捨てます。細胞ペレットを1mLの培地で再懸濁し、よく混合します
   手記： 得られたcm大動脈あたりのECの平均数は1.9 x 10⁵±1.4 x 10⁴(平均±SD、n = 3)です。
10. セルカウンターでセルをカウントします。細胞番号に従って材料をコーティングせずに、容器内で細胞をプレート化して培養します。細胞数が1.0 x 10⁶以下の場合は、25cm²のフラスコで細胞を培養します。細胞数が1.0 x 10°より大きい場合は、25 cm²のフラスコ(フラスコあたり1.0 x 10°の細胞)で細胞を培養します。フラスコを5%CO₂を含む37°Cのインキュベーターに(振とうせずに)置き、2〜3日ごとに培地を交換します
    手記： 一部のセルは、セルスクレーパーによって損傷を受けます。細胞生存率アッセイでは、生細胞の割合は95.7%±1.7%であることがわかりました(平均±SD、n = 3)。単離された細胞の倍加時間は約1〜2日です。

結果

図1:ブタ大動脈消化とpAECの分離。 (ア) 大動脈は、冷間洗浄バッファーを備えた150mmのペトリ皿に入れられます。(B)結合組織を切除した後のブタ大動脈の写真。(ハ)ガラスバーは、ブタ大動脈を通過するために滅菌済みの外科用縫合糸で結ばれています。 (ダ) 大動脈の一端は滅菌済みの外科用縫合糸で結ばれており、大動脈の内側に保持されています。 (

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セルスクレーパー	コーニング	3010#
コラゲナーゼIV	シグマ・アルドリッチ	C5138#-1G
DMEM	ライフテクノロジー	11965118#
ファルコン100mm細胞培養皿	コーニング	353003#
シャーレ(150 x 15 mm)	バイオロジックスグループ	66から1515#
鉗子	ShangHai medical instruments Co.,Ltd.中国
長方形傾斜ネック細胞培養フラスコ、ベントキャップ付き(T25)	コーニング	3289#
鋏	ShangHai medical instruments Co.,Ltd.中国
セロロジカルトランスファーピペット(10ml)	JETバイオフィル	GSP010010#
滅菌パスツールピペット	ジーンブリック	GY0025#
外科用縫合糸	上海浦東金環医療用品有限公司	5-0#
20 x PBS溶液(pH 7.4、ヌクレアーゼフリー)	サンゴンバイオテック	B540627#
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15070063#

の