出典:Perumal, N. et al., Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. J. Vis. Exp. (2019).
このビデオでは、ブタの眼から短い後毛様体動脈を分離するプロトコルについて説明しています。孤立した短い後動脈は、眼血管の分子的洞察とタンパク質プロファイルを解明するための適切な情報源です。
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方法論記事
短後毛様体動脈の分離:ブタの眼から無傷の短い後毛様体微小血管を切除するためのプロトコル
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 短い後毛様体動脈の分離
ブタの眼は、視神経組織および眼球外組織とともに、死後すぐに採取されました。除核された眼球は、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で研究室に運ばれ、すぐに使用されました。
>注:ブタの目は基本的に前部(図1A)と後部(図1B)に分けられます。
- アイグローブを氷冷したクレブス・ヘンセライト(K-H)バッファーを含む解剖チャンバーに入れます。鋭利なメイヨーハサミで周囲の筋肉や組織を丁寧に切り取ります
手記： Krebs-Henseleit(K-H)バッファーを調製するには、以下の化学物質(27.68 gのNaCl、8.4 gのNaHCO3、1.4 gのKCl、1.18 gのMgSO4、および0.64 gのKH2PO4)を1本の乾燥した清潔な50 mL円錐形遠心分離チューブに秤量し、1.47 gのCaCl2と8.0 gのグルコースを別のチューブに秤量します。これらの化学物質の粉末混合物は、涼しく乾燥した場所に保管する必要があります。CaCl2とグルコース粉末の混合物は、水分の吸収や凝集を防ぐために、新鮮に調製するのが最適です。 - メスで切開し、鋭いメイヨーハサミで赤道面に沿って地球を切開し、目が前半分と後半分に分かれるまで切ります。一対の標準パターン鉗子を使用して、眼の後半分からできるだけ多くの硝子体を取り除きます.
手記： 眼球を2つに分離することで、解剖皿に目が動かなくても、短い後毛様体動脈(sPCA)の分離が容易になります。ただし、この手順は必須ではありません。血管は、眼球を開かずに分離することもできます。 - 解剖ピンを使用して、網膜を下にして視神経を実験者に向けて眼の後半分を慎重に固定します。
- 視神経を囲む結合組織をそっと切り取り、Student Vannasスプリングハサミで下にある眼球後血管系を露出させます。
- sPCAは、強膜を貫通し、視神経乳頭を円周方向に囲む血管の短い枝(5〜8本の枝)として見ることができます(図1C)。パラプタルおよび遠位sPCAを周囲の結合組織とともに、タイプ5の精密ピンセットとVannas嚢切開ハサミで分離します(図1D).
手記： 分離手順全体を通して、K-Hバッファーが氷のように冷たく保たれていることを確認します。周囲温度に応じて、20〜30分ごとにバッファーを交換することを強くお勧めします。
2. サンプル調製
- 実体顕微鏡で極細タイプ5精密ピンセットとバンナス嚢切開ハサミを使用して動脈セグメントから結合組織を優しく除去し、分離された動脈を氷冷PBSですすいで汚染物質と血液残留物を除去します
手記： サンプルをすぐに次のステップに進まない場合は、液体窒素で急速冷凍し、さらに使用するまで-80°Cで保存してください。
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結果
図1:ブタの目の代表的な写真。
(A) 眼球の側面図は、眼の前部に位置する角膜、強膜、周囲の筋肉および視神経を示しています。(B)眼の後方図は視神経を示しています。(C)眼球の後ろに見られるsPCAの枝は、傍視神経と遠位の枝で構成されています。(D)周囲の脂肪および結合組織を含む単離されたsPCA。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 塩化カルシウム二水和物(CaCl2) | カール・ロス | 5239.1 | 2.5 mM |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14190169 | |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | カール・ロス | 9265.2 | 118.3 mM |
| 炭酸水素ナトリウム(NaHCO3) | カール・ロス | 965.3 | 25メートル |
| α-(D)-(+)-グルコース一水和物 | カール・ロス | 6780.1 | 11 mM |
| 使い捨てメス #21 | pfmメディカル | 200130021 | |
| 解剖ピン | カール・ロス | PK47.1 | |
| エクストラファインボンハサミ | ファインサイエンスツール | 14084-08 | |
| ファルコンコニカル遠心チューブ(50 mL) | フィッシャーサイエンティフィック | 14-432-22 | |
| マヨハサミ、タフカット | ファインサイエンスツール | 14130-17 | |
| 精密ピンセット | ファインサイエンスツール | 11251から10 | タイプ5 |
| 精密ピンセット、ストレート、極細チップ | カール・ロス | LH53.1 | タイプ5 |
| 標準パターン鉗子 | ファインサイエンスツール | 11000から12 | |
| 学生ヴァンナスの春のはさみ | ファインサイエンスツール | 91501から09 | |
| Vannas嚢切開はさみ | Geuder | 19760 | ストレート、77 mm |
