極低温ストローを用いたウサギ胚ガラス化:ウサギ胚を長期保存するための超急速冷却技術

要約

出典:Garcia-Dominguez, X. et al. Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、エチレングリコールとジメチルスルホキシドを凍結保護剤として、極低温ストローをキャリアシステムとして使用して、目的の発生段階で採取したウサギ胚のガラス化の手順について説明します。ガラス化胚は生存率が高く、使用まで長期間保存することができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 胚ガラス化

1. 室温(約22°C)ですべての操作を行い、高温でのガラス固化溶液の毒性を低減します
   手記：このプロトコルでは、0.1〜2μLの自動ピペットを使用して胚を移動させることができますが、最小容量を引きずって胚を移動させる他の同様の装置が適している可能性があります。
2. 2段階の追加手順で胚をガラス化します。
   1. 10%(v / v)エチレングリコールと10%(v / v)ジメチルスルホキシドを塩基培地(BM)に溶解した平衡溶液に胚を2分間置く。(BMの組成:Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に0.2%(w / v)のウシ血清アルブミンを添加)
   2. 胚(ステップ1.2.1から)を1分間、BMに溶解した20%(v / v)エチレングリコールと20%(v / v)ジメチルスルホキシドからなるガラス化溶液に移します。
3. 胚を0.25mLのプラスチック製ミニストロー(綿栓付きの閉じた端と開いた端が1つ入っています)に入れます。このプロセスを図 1 に示します。
   1. 0.25 mLミニストローの閉じた端を適切なマイクロディスペンサー(Captroll III®など)と組み合わせます。
   2. ストローの長さの1/3までBMを吸引し、続いて小さな気泡を送ります。
   3. 胚を40μLの容量のガラス固化溶液で吸引し、続いて別の小さな気泡を吸引します。
   4. 最初の液体画分(ステップ1.3.2)が綿に到達するまでBMを吸引します。
   5. 開放端をストロープラグで閉じます。
4. ステップ1.3の実行中にステップ1.2.2を実行し、胚に毒性のある1分以上経過しないようにします。
5. ミニストローを直接液体窒素に突っ込んでガラス化を実現します。
6. ミニストローを窒素用のデュワーに保管します。

結果

図1:正しくロードされたストローの図式化。A)BMとは、ガラス化中に使用される胚操作培地を指します。胚はガラス化溶液にロードする必要があります。 B)胚の位置の拡大された詳細を備えた装填されたストローの巨視的な外観。この大容量デバイスにより、最小容量のデバイスとは異なり、多数の胚をガラス化することができます。さらに、このデバイスの取り扱いは、最小ボリュームのデバイスに比べて簡単です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清アルブミン(BSA)	VWRの	332
ジメチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ	W387509
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	シグマ・アルドリッチ	D5773	塩化カルシウムなし。
エチレング リコール	シグマ・アルドリッチ	102466-M
液体窒素	エア・リキード	P1505XXX
プラスチックストロー 0.25mL	IMV - テクノロジー	6431
実体顕微鏡	ライカ	MZ16F	いくつか例を挙げると、ライカMZ8、ニコンSMZ-10、SMZ-2Bなどの安価なオプションがあります。
ストロープラグ	IMV - テクノロジー	6431