ウサギへの胚移植:排卵レシピエント雌ウサギモデルの卵管への胚の腹腔鏡ガイド下移植の手順

要約

出典: Garcia-Dominguez, X. et al., Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、腹腔鏡検査によってレシピエントの雌ウサギの卵管に胚を移植する技術について説明しています。それは卵管を通る移動の間にウサギの胚のリモデリングを可能にし、最終的に成功した着床を助ける。この技術は、保存されている胚にも効率よく使用できます。

プロトコル

1. 胚移植

1. レシピエント女性の準備
   1. 性的に成熟した女性(生後4.5か月>)のみを使用してください。
   2. ETの1週間前に、女性を16時間の明るい/8時間の暗い体制に適応させて、卵胞の成長と女性の受容性の向上を開始します。
   3. 外陰部の濁りと色を観察しながら、レシピエントの女性を選択します。外陰部が膨らんで赤みがかっている場合、女性は受容的です。
   4. 体重に関係なく、酢酸ブセレリン(ゴナドトロピン放出ホルモンの合成類似体)1μgの単回筋肉内注射により偽妊娠(排卵)を誘発します
      注:通常、0.8μgは中型ウサギ(4〜5 kg)の排卵誘発に適した用量であるため、1μgは一般的に排卵を保証します。
   5. 移植する胚の年齢と同じ日数前に排卵を誘発します(たとえば、新鮮な桑実胚ETの70〜72時間前)。
2. 麻酔と鎮痛
   1. ウサギの体重を量り、次の麻酔薬と鎮痛薬をロードします。
      1. 30G針付きの1 mLシリンジで、キシラジン(5 mg / kg)とブプレノルフィン塩酸塩(0.03 mg / kg)をロードします。.23Gの頭蓋周囲針を備えた別の1 mLシリンジに、塩酸ケタミン(35 mg / kg)をロードします。.
   2. ウサギを抱き、キシラジン-ブプレノルフィン混合物を筋肉内に注射します。.
   3. ケタミンを含む頭蓋周囲針を辺耳静脈に挿入し、すべての注射器の内容物をゆっくりと静脈内に挿入します。
   4. 針を固定し、残りのステップ全体に挿入したままにして、必要に応じてさらに麻酔を投与します。
   5. ウサギをケージに入れ(清潔で他の動物がいない)、暖かいステージに置きます。
   6. 意識を失ったら、目の乾燥を避けるために目の軟膏を塗り、眼瞼反射がないかどうかを確認します.
      手記：このプロトコルは、最低 30 分間の外科的麻酔面を提供します。より長い時間が必要な場合は、30分後に1.2.1に記載されている塩酸ケタミンの半分
   の量を追加で注入します。.
   7. ペダル反射と呼吸の動きを確認して、麻酔の深さを監視します。呼吸パターンが不規則で速い速度に変化することは、適切な麻酔面の喪失を示しています。
   8. 粘膜の色(目、唇など)、呼吸数(毎分30〜60回)、心拍数(毎分120〜325回)、直腸温(38〜39.6°C)を監視します。
   9. 移す8時間前に、ETプロセスが終了するまで、腸のサイズと活動が大きくならないように、動物からの食物を控えてください。水への自由なアクセスを残してください。
3. 胚の準備
   1. 胚操作培地を25°Cに温めます:ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)と0.2%(w / v)のウシ血清アルブミンを添加した塩基培地(BM)。
   2. 実体顕微鏡で作業し、新鮮または解凍した胚をBMですすいでください(ステップ2)。
   3. 滅菌手袋を使用して、適切に構成された17G硬膜外カテーテルを1mLシリンジに取り付けます。
   4. 1cmのBMをカテーテルに吸引し、続いて小さな気泡を
   吸います。
   5. 10μLのBMの容量で5〜7個の胚を吸引し、続いて別の小さな気泡を吸引します。
   6. BMを1cm吸引してカテーテルの装填を終了します。
4. 胚移植
   1. 無菌環境を確保するために、滅菌手袋、ガウン、マスクの使用を検討してください。
   2. 手術器具を滅菌し、手術が行われる表面を清掃し、70%エタノールで拭きます。
   3. 前に詳述したように麻酔を行い(ステップ1.2)、反射神経の喪失を確認します。
   4. 電気カミソリで腹側腹部から毛皮を剃ります。
   5. 腹側腹部を無菌的に準備します。
      1. 手術部位を清掃し、残っている髪の毛を取り除きます。手術部位をグルコン酸クロルヘキシジン石鹸で洗います。クロルヘキシジン溶液とエタノール96°C(3回)でその領域を消毒します。
   6. 動物をトレンデレンブルグの位置(頭を45°で下げる)の暖かい手術台に置き、胃と腸が頭蓋の位置にあることを確認します。膀胱が濁っている場合は、膀胱の排出を検討してください。その過程で内臓が損傷すると、動物は死亡する可能性があります。したがって、それらを適切に配置することが重要です(図1)。
   7. 滅菌タオルを使用してその領域を覆い、剃った領域を露出させる穴(開窓)で、手術部位を潜在的な汚染領域から分離します。
   8. 内視鏡的トロカールを腹腔内に 5 cm 挿入し、剣状突起に 2 cm 尾側に挿入し、それを介して圧力調整機械式送気器で腹腔を膨らませます><。 手記：腹腔内圧は、CO₂ で 8-12 mmHg である必要があります (図 1A)。
   9. 内視鏡カメラを内視鏡トロカールに挿入します(図1B).
      注:生殖管を特定し、ETの前に膨らみと膨大部の状態と位置を決定して、次のステップを容易にします。
   10. 17-G硬膜外針を、漏斗から2〜3cmの鼠径部に挿入します(図1B)。
   11. インファンディブルムの入り口を特定します(図2A、2B)。
   12. 装填したカテーテル(ステップ1.3)を硬膜外針から腹部に挿入します(図1C)。
   13. 卵管の位置を特定し、膨大部の眼疱瘠を通して硬膜外カテーテルを1〜2cm挿入します(図2A-2C)。損傷や出血を防ぐために、卵管にあまり進まないでください。
   14. カテーテルに結合されたシリンジのプランジャーを静かに押して、胚を卵管に放出します(図2D-2F)。両方の気泡がカテーテルから出る必要があります。
   15. 胚が放出された直後にカテーテルを抜く。
   16. カテーテルをすすぎ、吸引および放出する操作培地を放出して、胚の不在を確認し、それらが成功した移植を確認します。
   17. 必要に応じて、子宮の反対側で手順1.4.11から1.4.16を繰り返します。
   18. 硬膜外針と内視鏡カメラを取り外します。
   19. 内視鏡用トロカールを通じてCO₂を放出します。動物の腹部に過剰なガスが残っていると、痛みや不快感が生じます。
   20. 内視鏡トロカールを腹腔から取り外します。サージカルタオルを取り外します。
   21. 麻酔を中止します。
   22. トロカールによって行われた切開部をクロルヘキシジン溶液で洗浄します。トロカールによって行われた切開部を微粉アルミニウムとプラスチックドレッシングで閉じます。

結果

図1:腹腔鏡検査による腹腔鏡下胚移植(外観)。A) 内視鏡用トロカールの挿入(片方ポート) B) 内視鏡カメラと硬膜外針の挿入 (黒矢印) C) 硬膜外針による胚移植カテーテル(白矢印)の挿入。

図2:腹腔鏡検査による腹腔鏡下胚移植(内部図)。A:硬膜外針から腹部にカテーテルを挿入します。アスタリスクはインフロンダムを示します。 B、C、D:

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清アルブミン(BSA)	VWRの	332
ブプレノルフィン塩酸塩	アルベット・エスカルティ	626	資格のある獣医師が注文します。
ブセレリンアセテート	シグマ・アルドリッチ	B3303
CO2	エア・リキード	99921	CO2 N48です。
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	シグマ・アルドリッチ	D5773	塩化カルシウム不使用
電気カミソリ	オスターゴールデンA5	078005-140-002
内視鏡用カメラ	オプトミックスペインSA	OP-714
シリコン製リーフレットバルブ付き内視鏡トロカール	カールストルツ内視鏡イベリカS.A.	30114GKの	軽量トロカールモデル。
クロレキシジンジグルコン酸塩石鹸	アルベット・エスカルティ	0265DCCJ500Bシリーズ
頭蓋上ニードル 23G	アルベット・エスカルティ	514056353	小さな針も使用できます。
硬膜外カテーテル	Vygonコーポレート	187.1
硬膜外針	Vygonコーポレート	187.1
目の軟膏	アルベット・エスカルティ	5273
腹腔鏡検査装置	カールストルツ内視鏡イベリカS.A.	26003 AAの	ホプキンス®腹腔鏡、0º-mmストレートビューイング腹腔鏡、長さ30cm、5mmの作業チャネル。
光源	オプトミックスペインSA	フィブロラックス250
機械式CO2吸入器	カールストルツ内視鏡イベリカS.A.	エンドフレーター®
インサフラート用シリコンチューブ	r カール・ストルツ内視鏡イベリカ社	20400040
実体顕微鏡	ライカ	MZ16F	いくつか例を挙げると、ライカMZ8、ニコンSMZ-10、SMZ-2Bなどの安価なオプションがあります。
ウサギ	バレンシア工科大学	ラインA	Line VやLine HPなどの他の母系を使用できます。