接着培養細胞に核酸を導入するためのビーズローディング:接着性哺乳動物細胞に蛍光タンパク質をコードするプラスミドをロードする技術

要約

出典:Cialek, C. A. et al.接着性ヒト細胞へのタンパク質および核酸のローディングをビーズで行います。J. Vis. Exp.(2021年)。

この動画では、ビーズローディングを使用して付着した哺乳類細胞に核酸を導入する手順を説明します。

プロトコル

1. ビーズローディングセル

>注:必要に応じて、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を短時間洗浄し、次に最適な培地を2mL加えます。少なくとも30分間インキュベートします。

1. 目的のプラスミド、タンパク質、および/または粒子を含む3〜8μLの溶液を作ります。各タイプのプラスミドには~1 μg(0.1-1 pmol)を、タンパク質には~0.5 μg(0.01 nmol)を、実験要件に応じて使用します。タンパク質には、チューブの壁にタンパク質が取り残されないように、保持力の低いチューブを使用してください。溶液をPBSで最低3 μLまで増やし、ロードする細胞の全領域(つまり、チャンバーのマイクロウェル、図1B)をコーティングするように溶液の量を調整します。
2. ピペッティングを上下に動かしたり、チューブをフリックしたりして、溶液を完全に混合します。溶液を卓上型マイクロフュージでチューブの底まで短時間回転させます。
3. ビーズローディング溶液と細胞のチャンバーを組織培養フードに移します。組織培養フードの残りのステップを滅菌技術を使用して実行します。
4. 培地を細胞から取り出し、滅菌チューブに一時的に保存します。チャンバーの端からすべての培地を静かに吸引し、チャンバーを約45°の角度で傾けて、中央のマイクロウェルに残っている培地の滴を取り除きます。培地を取り外す際は、ピペットの先端がガラスに触れないように注意してください。これにより、細胞が剥がれたり失われたりする可能性があります。細胞が長時間乾燥しないように、次のステップにすばやく移動します。
5. ビーズローディング溶液をチャンバー中央のガラスマイクロウェルに静かにピペットで移します。オプション:チャンバーが完全に乾くのを許さずに、~30秒間穏やかに揺さぶってインキュベートします。
6. ガラスビーズの単層を細胞の上に穏やかに分散させます(できればビーズローディング装置を使用)(図1A)。ビーズがガラス底マイクロウェル内の細胞を完全に覆っていることを確認します。
7. チャンバーを2本の指でつまみ、~2インチ持ち上げてフードの表面に軽くたたいてしっかりと下げます。その高さから皿を落とすのとほぼ同等の力を使用します。合計 ~10 タップ繰り返します。
   手記： タップがセルを大幅に剥がさないようにしてください。タッピングは細胞の種類に合わせて最適化できます。細胞のロードが不十分な場合は、より強くタップします。ただし、多くのセルが剥がれる場合は、軽くたたきます。
8. チャンバーのプラスチック面にゆっくりとピペッティングして、メディウムをチャンバーにゆっくりと戻します。細胞を乱さずに浮遊ビーズを吸引してみてください。除去しすぎた場合は、この手順で事前に温めたメディアをさらに追加します。インキュベーター内で細胞を0.5〜2時間インキュベートします。

結果

図1:ビーズローディング装置、技術、およびタイムライン

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cm細胞培養皿	VWRの	82050-916	細胞の培養に使用
35 mm細胞培養ディッシュ	隼	353001	ビードローダーの構築に使用します
Attofluor セルチャンバー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A7816	カスタムビードローダーの構築に使用します
DMEM、高グルコース、グルタミンなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11960069	一般的な細胞培養での使用
ガラス底皿、35 mm、#1.5、14 mmガラス	MatTek株式会社	P35G-1.5-14-C	イメージングのためにこれらのチャンバーに細胞を播種します
ガラスビーズ、酸洗浄済み、≤106 μm	ミリポアシグマ	G4649	細胞に振りかけ、プラスミドDNAとタンパク質をビーズロードします
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM9625	滅菌1X PBSのワーキングストック
フェノールフリーDMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31053036	イメージング前に細胞に使用する
Opti-MEM、低血清培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31985070	ビーズローディング前の細胞インキュベートに最適な培地(オプションステップ)

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