ナノブレードによる核酸カーゴの送達:Cas9-sgRNA複合体をウイルス様粒子を介して標的細胞に送達する技術

要約

出典:Mangeot, P. E., et al.ウイルス様粒子(「ナノブレード」)を介した不死化細胞および初代細胞におけるCas9/sgRNAリボ核タンパク質複合体の送達。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、ゲノム編集のために標的細胞内にCas9-sgRNAリボ核タンパク質複合体をナノブレードベースで送達する技術を示しています。ナノブレードは、増殖して隣接する細胞に感染する能力を持たないウイルス様粒子であるため、バイオマテリアルやナノマテリアルの迅速かつ用量依存的な輸送に非常に有用です。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. sgRNAの設計とクローニング

注:sgRNAの設計に関するガイドラインは、https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing やHanna、Doenchなど、複数の情報源から入手できます。

1. 20 のヌクレオチド sgRNA 配列を設計したら、以下の一本鎖 DNA オリゴヌクレオチドを注文します。
   1. フォワード: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N は、プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列のない標的遺伝子座に対応します)
   2. 逆: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N は PAM 配列のない標的遺伝子座の逆補体に対応します)
      手記：オリゴヌクレオチドを注文する際に特別な変更は必要ありません(5'リン酸は必要ありません)。
2. 5 μL のアニーリングバッファー (500 mM NaCl、100 mM Tris-HCl、100 mM MgCl2、10 mM DTT、pH 7.9、25 °C)、各 DNA オリゴヌクレオチド 1 μL (100 μM 水溶液)、および 42 μL の水を混合して、0.2 mL ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブ内で 2 つの DNA オリゴヌクレオチドをハイブリダイズします。
3. PCRブロック上で、サンプルを95°Cで15秒間インキュベートした後、0.5°C/sのランプで温度を20°Cに下げます。室温で保存するか、-20°Cで保存してください
   手記：ここでプロトコルを一時停止できます。
4. 10 μgのBLADEまたはSUPERBLADE sgRNA発現プラスミドと10ユニットのBsmBI-v2制限酵素を55°Cで3時間消化し、総反応容量50 μL.
   手記：消化されたベクターは、~1.9 kbのDNAインサートと~3.3 kbの2番目のDNAフラグメントを放出するはずです。
5. 5 μg/mLのエチジウムブロマイド(またはより安全な代替DNAゲル染色)で染色した1%アガロースゲルに制限反応をロードします。
   手記：遺伝的欠陥の原因と疑われる臭化エチジウムを操作する場合は、適切な保護具を着用してください。
   1. 波長312 nmに設定された紫外線(UV)テーブル(DNAの損傷を防ぐため)で、ゲルから3.3 kbのDNAフラグメントを切り取り、1.5 mLの微量遠心チューブに入れます><。 注意: 臭化エチジウムを操作し、UVテーブルで作業するときは、適切な保護具(手袋とUV保護ゴーグル)を着用してください。
   2. 専用のDNAゲル抽出キットを使用して、3.3 kbのDNAフラグメントを含むスライスゲルからDNAを抽出します(材料の表を参照)。分光光度計を使用して精製されたDNAの量を定量します.
      注:プロトコルはここで一時停止できます。
6. ステップ1.2のハイブリダイズされたフォワードおよびリバースDNAオリゴヌクレオチドを、ステップ1.5.2のBsmB1消化ゲル精製BLADESまたはSUPERBLADEベクターにライゲーションします。このためには、2 μL の T4 DNA リガーゼバッファー、50 ng のゲル精製ベクター (ステップ 1.5.2)、1 μL のハイブリダイズされた DNA オリゴヌクレオチド (ステップ 1.2)、水を加えて容量を 19 μL に、1 μL の T4 DNA リガーゼを添加します。反応液を25°Cで10分間インキュベートします。
   1. ライゲーション産物をコンピテントバクテリアに変換します(材料表を参照)。形質転換した細菌をアンピシリンLuria Bertani寒天プレートにプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
   2. 寒天プレート上でいくつかの単離コロニーを選択してDNAミニ調製を行い(材料表を参照)、U6フォワードプライマー(5'GACTATCATATGCTTACCGT 3')を使用してサンガーシーケンシングを行い、sgRNA可変配列の正しいライゲーションを確認します
      注:他のsgRNA発現プラスミドは、Cas9タンパク質をコードしていない場合に使用することができ、Nanobladeの産生を妨げる可能性があります。

2. プラスミド調製

1. 必要なすべてのプラスミドのマキシプレパレーション(材料表を参照)を行い、-20°Cで保存するために10 μgのアリコートを1 μg/mLで調製します。プラスミドの凍結/融解サイクルの繰り返しを避け、アリコートを廃棄する前に2回使用してください。

3. ナノブレードの調製

1. 1日目に、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、10%ウシ胎児血清(FBS)、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含む10mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に3.5〜×4個の10⁶ HEK293T細胞(材料の表を参照)を播種します10cm細胞培養皿に入れます。10 cmプレートをゆっくりと前後に動かし、次に右から左に動かし(このシーケンスを5回繰り返します)、培養皿上に細胞を均一に分布させます。細胞インキュベーターで細胞を 37 °C でインキュベートし、5% CO₂.
   手記：培養細胞およびナノブレードの取り扱いに関連するすべての手順は、それらの汚染を避けるために、細胞培養層流フードの下で実行する必要があります。
2. 2日目:プラスミドトランスフェクション
   1. セルは、めっき後24時間で70〜80%がコンフルエントである必要があります(図1A)。トランスフェクション前に、高グルコース、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、10%FBS(ペニシリンとストレプトマイシンは必須ではありませんが省略できます)を含む新鮮なDMEM10mLと培地を交換してください
      注:このステップでは、セルがコンフルエントでないことが重要です。そうしないと、トランスフェクション効率と粒子生成が低下する可能性があります。
   2. 10 cm プレートごとに、1.5 mL チューブに 0.3 μg の pCMV-VSV-G、0.7 μg pBaEVRless、2.7 μg MLV Gag/Pol、1.7 μg の BIC-Gag-Cas9、4.4 μg のクローニングされた sgRNA をコードする BLADES または SUPERBLADES プラスミド (2 つの sgRNA を使用する場合は各 2.2 μg) を調製します。
   3. トランスフェクションバッファー 500 μL (材料表を参照) を添加し、ボルテックスで 10 秒間ボルテックスした後、1 秒間遠心分離します。トランスフェクション試薬 20 μL を添加し (材料表を参照)、チューブを 1 秒間ボルテックスし、次に 1 秒間遠心分離します。
   4. 室温で10分間インキュベートし、P1000ピペッターを使用してDMEM培地中の細胞に溶液全体を滴下します。10 cmプレートをゆっくりと前後に動かし、次に右から左に動かし(このシーケンスを5回繰り返します)、トランスフェクション試薬を細胞全体に均一に分散させます。細胞を37°Cで少なくとも40時間インキュベートし、5% CO₂.
      手記：必要に応じて、トランスフェクションの4時間後に培地を交換することができます。
3. 3日目は、トランスフェクションした細胞の形態を顕微鏡で確認します.
   手記：生産者細胞が融合し始めます。これは、フソジェニックウイルスエンベロープの発現による正常な発生です(図1B、C)。
4. 4日目:ナノブレードの収穫
   手記：トランスフェクションの少なくとも40時間後、細胞は融合したウイルスエンベロープの発現により融合し、場合によっては細胞がプレート支持体から完全に分離します(図1D)。
   1. 10 mLピペットを使用して、培地上清9 mLを回収します
      手記：ナノブレードは、Cas9タンパク質とそれに関連するsgRNAを初代細胞およびin vivoに送達できるVLPです。遺伝物質がないため、遺伝子組み換え生物とは見なされませんが、遺伝的変化を誘発する可能性があります。したがって、ユーザーとの接触を避けるために、注意して操作する必要があります(特に、腫瘍抑制遺伝子を標的とするようにプログラムされている場合)。ユーザーは、レトロウイルスベクターの操作に関する地域の安全ガイドラインに従い、VLPの調製および形質導入実験の実施に際してはBSL-2レベルの研究室で作業することをお勧めします。ナノブレードは、70%エタノールまたは0.5%の次亜塩素酸ナトリウムで不活化できます。また、すべてのプラスチック廃棄物(ピペットチップ、組織培養プレート、遠心分離チューブ)を0.5%次亜塩素酸ナトリウムで少なくとも10分間処理して、Nanobladeを不活性化することをお勧めします。
   2. 回収した上清を500 × gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さずに細胞破片を除去し、上清を回収します
      注:Nanobladeを初代細胞に使用する場合は、0.45 μmまたは0.8 μmのフィルターを使用して上清をろ過します。このステップにより、フィルター膜でかなりの部分がブロックされるため、Nanobladeの力価が大幅に低下することに注意してください。
   3. Nanobladesをスイングバケットローターで一晩(12〜16時間)ペレット化し、4,300 × gまたは209,490 × gの超遠心分離機で4°Cで75分間(材料表を参照)
      注:標的細胞がDMEMで増殖できる場合、Nanobladesを濃縮することなく、ステップ3.4.2以降に得られた上清と直接インキュベー
   トすることができます。
5. 5日目:ナノブレードの再懸濁と保管
   1. 遠心分離後、培地をゆっくりと吸引し、白色ペレットを100 μLの冷たい1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再懸濁します。チューブをパラフィルムで覆い、4°Cで1時間インキュベートし、穏やかに攪拌してから、ピペッティングで上下させてペレットを再懸濁します><。 手記：再懸濁すると、白い粘性物質が現れることがあります。これは正常であり、形質導入の効率に大きな影響を与えません。
   2. Nanobladeを4週間以内に使用する予定の場合は、4°Cで保管してください。それ以外の場合は、Nanobladeを液体窒素で急速冷凍し、-80°Cで保存します
      注意: 液体窒素を操作するときは、保護ゴーグルと極低温手袋を着用してください。スナップ凍結して-80°Cで保管すると、Nanobladeの効率が大幅に低下します。さらに、解凍したナノブレードは再度冷凍しないでください。ここでプロトコルを一時停止できます。

4. ショ糖クッション上のナノブレードの濃度

>注:一晩の遠心分離または超遠心分離(ステップ3.4.3)の代替として、ナノブレードをショ糖クッションに集中させることができます。これにより、より純粋なナノブレードが得られますが、回収される総量は少なくなります。

1. 1x PBSに10%ショ糖溶液(重量対体積)を調製し、0.2 μmシリンジフィルターでろ過します(材料の表を参照)。
2. ナノブレードをショ糖クッションに集中させるプロセスを開始します。
   1. 9 mLのVLP含有サンプル(ステップ3.4.3から)を超遠心チューブに入れます(材料表を参照)。3 mLのシリンジとカニューレを使用して、VLP含有サンプルとショ糖溶液を混合しないようにしながら、10%スクロース2.5 mLをサンプルの下にゆっくりと重ねます。
   2. または、2.5 mLの10%スクロースを超遠心チューブに入れます(材料の表を参照)。チューブを傾け、低速ピペッターで9 mLのVLP含有サンプル(ステップ3.4.3から)をゆっくりと加えます。この操作中に、チューブを徐々に垂直位置に上げます。
3. サンプルを209,490 g×gの超遠心分離機で4°Cで90分間遠心分離します
   手記：この技術は、低速遠心分離(4,300 × g)に一晩中適用できます。
4. 遠心分離後、上清を慎重に取り除き、チューブを逆さまにしてティッシュペーパーの上に置き、残っている液体を取り除きます。1分後、1x PBS100 μLを加え、チューブホルダーにパラフィルムカバーを入れてチューブを4°Cに置き、撹拌テーブルに1時間(材料表を参照)してから、ピペッティングで上下させてペレットを再懸濁します
   注:プロトコルはここで一時停止できます。

5. ナノブレード内のCas9負荷をドットブロットでモニタリング

1. 希釈バッファーを調製するには、非イオン性界面活性剤(材料表を参照)を含む1容量の溶解バッファーを4容量の1x PBSに加えます。2 μLの濃縮Nanobladeを50 μLの希釈バッファーで希釈し、短時間ボルテックスし、この混合物の25 μLを25 μLの希釈バッファーを含む新しいチューブに移します。この操作を繰り返して、Nanoblade希釈液を4本入れます(2倍希釈ステップ)。
2. 標準コントロールでは、2 μL の組換え Cas9 ヌクレアーゼ (材料表を参照) を 50 μL の希釈バッファーに希釈し、短時間ボルテックスして、8 回の段階希釈 (各ステップで 2 倍希釈) を行います。
3. 各VLP希釈液2.5 μLおよび各標準液2.5 μLをマルチチャンネルピペットでニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットします(容量が多いとスポットが重なる場合があります)
   手記：メタノール処理されたポリフッ化ビニルジフッ化ビニルメンブレンも使用され得る。
4. 粒子がメンブレンに吸収されたら、非イオン性界面活性剤(TBS-T)を含む1x Tris緩衝生理食塩水でメンブレンをブロックし、脱脂粉乳(5%w / v)を補充し、室温で45分間
   手記：ここでプロトコールを一時停止し、メンブレンは1x TBS-Tで4°Cで保存することができます。
5. 脱脂粉乳を添加した1x TBSTを廃棄し、Cas9-西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体(1x TBST、5%牛乳で1/1000希釈)とメンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。TBS-Tでメンブレンを3回洗浄し、強化された化学発光基質キットを使用してシグナルを可視化します。
6. Nanobladesおよび組換えCas9標準希釈液のドット強度を、ゲルイメージングステーションまたはimageJに付属の専用ソフトウェアを使用して定量化します。ドット強度をCas9濃度にリンクする線形曲線を定義します。得られた曲線の関数を使用して、各調製物中のCas9含有量を外
   手記：組換えCas9タンパク質コントロールの量は、標準希釈セットの最も濃縮されたサンプルの読み取り値を飽和させる可能性があります(図2)。したがって、線形曲線を定義する際には、未希釈のサンプル(場合によっては最初の希釈ステップ)から読み取り値を削除することをお勧めします。これらのサンプルが、スポットされたCas9の既知の濃度に対して線形範囲にない場合。同様に、Nanobladeサンプル内のCas9の量を外挿する場合は、標準曲線の線形範囲内にある読み取り値のみを使用してください。

6. ナノブレードによる標的細胞の形質導入(12ウェルプレートでの形質導入の手順)

1. 12ウェルプレートで、ウェルあたり100,000〜200,000個の細胞(初代または不死化接着細胞)を適切な細胞培養培地1mLに播種します。形質導入の前に細胞をプレート表面に接着させます。
2. 1.5 mLの微量遠心チューブに、5-20 μLの濃縮ナノブレード(ステップ3.5.1または4.4)を500 μLの細胞培養培地に加え、P1000ピペッターでピペッティングして混合します。培地を細胞から取り出し、このナノブレード混合物の500μLと交換します><。 手記：形質導入は、細胞の種類ごとに最適化する必要があります。ナノブレードが高濃度に保たれるように、(標的細胞の乾燥を避けながら)可能な限り少量の培地を使用することが重要です。接着細胞は、プレートに付着した状態で直接形質導入する必要があります(浮遊液中で形質導入すると形質導入効率が大幅に低下するため、形質導入しないでください)。一部の細胞はNanobladeへの長時間の曝露(24〜48時間)に耐えますが、他の細胞は非常に敏感で、小さな合胞体を形成する可能性があります。この場合、Nanobladeは、培地を交換する前に4〜6時間だけ細胞とインキュベートする必要があります。スピノキュレーションは、懸濁液中で増殖した細胞の形質導入も改善できます。カチオン性ポリマーなどのアジュバント(材料表を参照)も、一部の細胞タイプで形質導入効率を向上させることができます。
3. Nanobladesを含む少量の培地で4〜6時間の細胞インキュベーションを行った後、培地の量を正常量(12ウェルプレートを使用する場合は1mL)まで増やすか、細胞がVLPに感受性がある場合は新しい培地と交換します
   手記：Nanobladesを含む細胞培地は、廃棄する前に0.5%次亜塩素酸ナトリウムで10分間不活化する必要があります。次亜塩素酸ナトリウムを操作するときは、手袋と保護ゴーグルを使用してください。ナノブレードが細胞死を誘発する場合は、曝露量と総時間を適応させて細胞死亡率を低下させます。

結果

図1:ナノブレード製造中の生産者細胞の形態。(A)めっき後24時間で70〜80%のコンフルエントで細胞をHEK293T。(BおよびC)トランスフェクションの24時間後に細胞形態HEK293T。(D)トランスフェクションの40時間後のHEK293T細胞形態。スケールバー = 400 μm。

図2:ドットブロットによるナノブレード内のCas9負荷の定量化。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
13.2 mL、薄肉ポリプロピレンチューブ、14 x 89 mm - 50個入り	ベックマン・コールター ライフサイエンス	331372	ナノブレード精製用の超遠心チューブ
Amersham Protran Premium Western ブロッティングメンブレン、ニトロセルロース	メルク	GE10600004	精製ナノブレード内のCas9レベルを定量するためのニトロセルロースメンブレン
BIC-ギャグ-CAS9	アドジーン	119942	GAG(F-MLV)-CAS9(sp)融合をエンコードします。過剰発現したgRNAおよび適切なエンベロープと関連して、産生細胞からのGAG-CAS9ウイルス様粒子の産生を可能にします。
BICstim-ギャグ-dCAS9-VPR	アドジーン	120922	GAG-dCAS9-VPR融合をコードし、標的転写活性化を促進
刃	アドジーン	134912	ナノブレードシステムで使用するsgRNA配列をクローニングするための空のバックボーン
BsmBI-v2	ニューイングランドバイオラボ	R0739Sの	sgRNAクローニング用のBLADEおよびSUPERBLADESベクターを消化するための制限酵素
Cas9 (7A9-3A3) マウスmAb (HRP Conjugate) #97982	細胞シグナル伝達技術	97982S	ドットブロットによるCas9定量のための抗Cas9抗体
Cas9ヌクレアーゼ、化膿性ブドウ球菌	ニューイングランドバイオラボ	M0386T型	ナノブレード内にロードされたCas9の量を絶対定量するための参照として使用する組換えCas9タンパク質
エチジウムブロマイド溶液(H2O中10 mg/mL)	シグマ・アルドリッチ	E1510-10ミリリットル	アガロースゲルの染色とDNAの可視化に
フィッシャーブランドウェーブモーションシェーカー	フィッシャーサイエンティフィック	〒88-861-028	遠心分離時にナノブレードを再懸濁するための撹拌テーブル
ゲルアナライザー			http://www.gelanalyzer.com;消化後のバンド強度の定量化
Gesicle プロデューサー 293T	タカラ	632617	Nanoblades産生細胞株
Gibco DMEM、高グルコース、ピルビン酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41966052	Gesicle Producer 293T細胞用細胞培養液
DNAおよびDNA/siRNA用のjetPRIMEトランスフェクション試薬キット	ポリプラス	ポール114-15	Gesicle Producer 293T細胞におけるナノブレード作製用トランスフェクション試薬
Millex-AA、0.80 μm、シリンジフィルター	ミリポア	SLAA033SS	ナノブレードの濃縮前に細胞の破片を除去するシリンジフィルター
Millex-GS、0.22 μm、シリンジフィルター	ミリポア	SLGS033SS	ショ糖クッション溶液を滅菌するためのシリンジフィルター
Millex-HP、0.45 μm、ポリエーテルスルホン、シリンジフィルター	ミリポア	SLHP033RS	ナノブレードが集中する前に細胞の破片を除去するシリンジフィルター
Monarch DNAゲル抽出キット	ニューイングランドバイオラボ	T1020Lの	BsmBIによる消化時にpBLADESまたはpSUPERBLADESプラスミドフラグメントを精製するためのDNAゲル抽出キット
NEB安定コンピテント大腸菌(高効率)	ニューイングランドバイオラボ	C3040Iの	プラスミドの形質転換と増幅に適した細菌
NucleoBond Xtra Midi キット(トランスフェクショングレードプラスミド DNA 用	マシェリー・ナーゲル	740410.5	培養細菌からのプラスミドDNAの精製のためのMaxi調製キット
Nucleospin gDNA抽出キット	マシェリー・ナーゲル	740952.5	形質導入細胞からのゲノムDNAの抽出
NucleoSpin Plasmid、プラスミドDNA用ミニキット	マシェリー・ナーゲル	740588.5	培養細菌からプラスミドDNAを精製するためのミニプレパレーションキット
NucleoSpin Tissue、細胞および組織由来のDNA用ミニキット	マシェリー・ナーゲル	740952.5	ゲノムDNA抽出キット
オプティマ XE-90	ベックマン・コールター ライフサイエンス	A94471(英語)	超遠心分離機
pBaEVRレス	エルス・フェルホーエン (Inserm U1111)	個人リクエストは、次の宛先に送信する必要があります els.verhoyen@ens-lyon.fr	ヒヒ Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baヒ エンベロープ pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-ガグポール	アドジーン	35614	マウス白血病ウイルスのギャグとpol遺伝子を解読します
pCMV-VSV-Gの	アドジーン	8454	レンチウイルスおよびMuLVレトロウイルス粒子を産生するためのエンベロープタンパク質
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14200091	ミリポア水で希釈するための10倍PBS
ポリブレントランスフェクション試薬	ミリポアシグマ	TR-1003-G	特定の哺乳類細胞におけるレトロウイルス形質導入の効率を高めるカチオン性ポリマー。また、オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)のウイルス依存的な侵入を可能にし、相同性指向修復を行う
ショ糖、分子生物学用、≥99.5%(GC)	シグマ・アルドリッチ	S0389-5KGシリーズ	超遠心分離によるナノブレード精製のためのクッションを調製するためのショ糖
SUPERBLADE5	アドジーン	134913	ナノブレードシステムで使用されるsgRNA配列をクローニングするための空のバックボーン(Chen B et al., 2013によるゲノム編集効率の向上に最適化)
SuperSignal West Dura エクステンデッド デュレーション サブストレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	34076	Cas9ドットブロット用の増強化学発光(ECL)HRP基質
SW 41 Ti スイングバケットローター	ベックマン・コールター ライフサイエンス	331362	超遠心分離用ローター
SYBR Safe DNA ゲル染色剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S33102	臭化エチジウムの代替品として、アガロースゲルの染色とDNAの可視化が
T4 DNAリガーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0202S(英語)	DNAリガーゼにより、BLADEまたはSUPERBLADESベクターを、sgRNAの可変領域に対応する二本鎖DNAオリゴとライゲーションします。
Triton含有溶解バッファー	プロメガ	E291A型	ナノブレードを破壊し、Cas9の定量を可能にする溶解バッファー
トゥイーン20	シグマ・アルドリッチ	P9416	TBSTの準備のために

の ) こともできます 可能 型