方法論記事

蚊胚マイクロインジェクション:ハマダラカの胚卵黄に外因性DNAを送達して生殖細胞変異を生成する技術

2025年7月8日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典: Carballar-Lejarazú, R. et al, Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos. J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、胚マイクロインジェクション技術を通じて、ハマダラカの蚊の胚への遺伝子ドライブ構築物の送達を実演します。この手順により、相同組換えを通じて送達されたDNAコンストラクトを生殖細胞に統合し、形質転換された蚊の集団を生成することができます。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 胚マイクロインジェクション

  1. マイクロローダーチップを使用して、2μLのDNA混合物(濃度300〜400 ng/μLのプラスミドDNA)を針に充填します。針を針ホルダーに挿入し、自動圧力ポンプチューブを接続します(図1)。
  2. 重要: スライドの平面に対して15°の角度になるように針を位置合わせします(図1)。
  3. ハマダラカ(Anopheles gambiae)蚊の1個目の卵に丁寧に触れて針先を開き、針先を後極に10μm≤挿入して注入します。注射が成功すると、卵子内の細胞質がわずかに動きます。
  4. 顕微鏡の同軸ステージコントロールを使用して、次の卵子に移動し、注入を続けます。
    1. 針先が開いたままで詰まっていないことを確認するには、別の胚に入る前に注入ボタンを押し、針の開口部にある小さな液滴を視覚化します。
    2. 針が詰まった場合は、クリアボタンを押して針をクリアし、飛沫可視化テストを繰り返します。針先の開口部が少し大きくなる場合は、必要に応じて圧力を調整して、液滴のサイズが小さく保たれるようにします。
    3. 1本の針で~40-50個の卵を注入します.
      手記：濾紙が常に湿っていることを確認してください。針を空けておくために、針に十分な背圧をかけてください。詰まりを解消できない針は、新しい針と交換する必要があります。胚の埋入、針の挿入、注入は、ステージの水平移動を同軸に制御する顕微鏡を使用することで容易になります(図2)。
  5. 注入が完了したら、濾紙で裏打ちされ、50mLの脱イオンH2Oが充填されたガラス容器に卵を洗い流します(図3)。
    手記： 胚は注入後2日で孵化を開始し、3〜5日かかる場合があります。孵化した最初の幼虫は、水と餌の入った清潔な容器にすぐに(1日2回チェック)移す必要があります。

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結果

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figure-results-1
図1:マイクロインジェクション中の針の位置。A)インジェクションステージの広角図。B、C)整列した胚が注射針に対して15°の角度を形成するように針を配置します。針と胚を含むスライドとの間の適切な角度を確保するために、針を顕微鏡ステージよりも大幅に高く保持するマイクロインジェクション機器のアームを持ち上げないでください。

figure-results-2
図2:同軸制御装置とニードルホルダー。 A)同軸制御(矢印)により、針の3次元移動が可能になり、各注射の針が正確に...

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x マイクロインジェクションバッファー--1 mM NaHPO4 バッファー、pH 6.8、50 mM KCl
ブロッティングメンブレン(Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)バイオ・ラッド2×1cmの小片にきれいにまっすぐにカット
脱イオン水または二重蒸留水(ddH20)ミリQウォッシュボトルに
解剖顕微鏡ライカライカMZ12胚のアライメント用
ガラス容器パイレックス第3140号125×65
スライドガラスフィッシャーブランド番号 12-549-375×26ミリメートル
マイクロインジェクターサッターインストゥルメントXenoWorksデジタルマイクロインジェクター
マイクロローダーピペットチップエッペンドルフ20 μL マイクロローダ epT.I.P.S.
マイクロマニピュレーターサッターインストゥルメントXenoWorksマイクロマニピュレーター
マイクロピペットレイニン20μL
顕微鏡ライカDM 1000 LED または M165 FCマイクロインジェクション用
ナイロンメッシュ
ペイントブラシブリック第05831-7040号ファイン、サイズ4/0
ペトリ皿プラスチック、(60x15 mm、90x15 mm)

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タグ

DNA

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