流体力学的遺伝子導入:尾静脈注射によるマウス肝細胞の外因性DNAのin vivoトランスフェクション技術

要約

出典:Hubner, E. K. et al., Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、流体力学的尾静脈注射によるマウス肝細胞の遺伝的in vivoトランスフェクションの技術について説明しています。このトランスフェクションシステムは、肝細胞における導入遺伝子の長期発現を生じさせます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 流体力学尾静脈注射液の調製

注:コンピテントバクテリアを使用したクローニング技術により、構成的および誘導性遺伝子発現のためのプラスミドコンストラクトを調製します。

1. 注射用の滅菌0.9%生理食塩水を調製します(PBSは使用しないでください)。マウスの体重の約10%に相当する体積を使用してください。例:体重20 gのマウスの場合、2 mLの溶液を調製します。
2. エンドトキシンフリープラスミド精製キットを使用して精製した注入ベクターを調製します。
3. 10 μgまたは15 μgのエンドトキシンフリーの眠れる森の美女ベクターコンストラクト(ステップ4からそれぞれ10 μgを使用し、ステップ4からは15 μgを使用)と1 μgのエンドトキシンフリーpc-HSB5を滅菌生理食塩水1 mLあたり追加します。
4. 溶液を4°Cで最大4時間保存します。凍結しないでください。

2. 流体力学尾静脈注入の実施

1. 尾静脈注射には拘束具を使用します(市販または呼吸用と尾用の穴のある50mLの円錐管から調製)。チューブの底にティッシュペーパーを入れます。
2. 注射には、体重が20〜25 gの生後約8〜10週齢のマウスを使用します。
3. 注射前にマウスの体重を量り、体重(体重の10%に相当)に応じて注射量を調製します。滅菌済みの3 mLシリンジと27 Gニードルを注射用に調製し、必要な量で充填します。
4. マウスを拘束装置に置きます。ティッシュペーパーの量を調整して、動きのための最小限のスペースだけを残し、呼吸のための十分なスペースを残します。
5. マウスが定期的に呼吸していることを確認してください。
6. 赤外線ランプを使用して30〜60秒間テールを温めます。過熱の兆候がないか注意深く観察してください。
7. アルコール綿棒で尾を拭きます。
8. 尾の付け根に近い2つの側尾静脈のいずれかに針をほぼ水平に挿入します.
   手記：うまく配置すると、少量の血液が針の円錐形に戻る可能性があります。針の追加の動きは、針の変位および/または静脈の損傷につながる可能性があるため、積極的に吸引することはお勧めしません。
9. 総量を8〜10秒以内に尾静脈に注入します。
10. すぐにマウスを拘束装置から取り外します。注射創を少なくとも30秒間、または出血が治まるまで圧縮します。.
11. マウスを別のケージに入れます。マウスが手順から回復したら(約30〜60分)、マウスを元のケージに戻します。次の24時間のためにマウスを定期的にチェックしてください
    手記：マウスの軽度の鎮静は、注射後最大2時間定期的に観察されます。.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl 0.9%	ブラウン	3200905	静脈注射用キャリア
ファルコンコニカルチューブ50ml	コーニング ライフサイエンス	352095
赤外線ランプ	該当なし	該当なし	マウスの尾の加温に
HTVI用の眠れる森の美女-トランスポゾンベクターのクローニング用プラスミド。
ピーTC	該当なし		構成的遺伝子発現用ベクター
pEN_TTmcs	アドジーン	#25755	誘導性遺伝子発現のためのエントリーベクター
pEN_TTGmiRc2	アドジーン	#25753	GFPの共発現を伴うmiRshRNA発現誘導のためのエントリーベクター
pEN_TTmiRc2	アドジーン	#25752	GFPの共発現を伴わないmiRshRNA発現誘導のためのエントリーベクター
pTCアポエテト	アドジーン	#85578	ApoE.HCR.hAAT promotor による誘導性遺伝子または miR-shRNA 発現の発現ベクター
pTC-CMV-テト	アドジーン	#85577	CMVプロモーターによる誘導性遺伝子またはmiR-shRNA発現のための発現ベクター