アグロバクテリウムを介した遺伝子形質転換:遺伝子改変アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるイネゲノムの遺伝子組み換え法

要約

出典:Xu, D., et al. >Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオでは、Agrobacterium tumefaciensバイナリベクターを使用してイネゲノムの遺伝的形質転換を示しています。この細菌は、Agrobacterium virulenceタンパク質を使用して外来DNAプラスミドの転写を促進します。

プロトコル

1. イネの遺伝子組み換えと植物組織培養

1. カルス誘導と再生
   手記：新鮮な若いイネの花序を出発材料として使用して、カルスを誘導します(図1)。
   1. 減数分裂の段階で水田または温室から若い花序を収集し、小花の長さは1.6〜4.8 mmで決定します(図1A)。米の花序が葉の鞘で覆われていることを確認してください。各花序を70%アルコール綿棒で拭き、乾かしてから切断します。
   2. 花序をきれいな滅菌ベンチに持ってきます。滅菌したハサミで細かく切り(小さいほど良い)、次にNBD2培地を含むペトリプレートに切り取ります(図1B、表1)。
   3. プレートを26°Cの暗所で約10〜14日間インキュベートして、カルスを誘導します(図2A).
      手記：新たに形成したカルスをアグロバクテリウム浸潤用に直接使用するか(ステップ1.2.7)、または新鮮なNBD2培地でもう一度再調整して、より多くのカルスを取得します。カルスを新しいNBD2培地に8〜10日ごとに移します。
2. 形質転換と共栽培
   1. 形質転換には、バイナリプラスミドとsgRNA-CAS9コンストラクトを含むA. tumefaciens細菌を使用してください。A. tumefaciens株を50%グリセロールを含むYEB培地(表1)に-80°Cで保存し、さらに使用してください。
   2. -80°Cのグリセロールストックから選択的抗生物質を含むYEB寒天培地(表1)にA. tumefaciensをストリークし、25〜28°Cで48〜72時間増殖してコロニーを出現させます。
   3. YEB プレートの 1 つのコロニーに選択的抗生物質を注入し、同じ選択的抗生物質 (表 1) を含む 5 mL の液体 YEB 培地に 50 mL の円錐形滅菌試験管に接種します。オービタルシェーカーで250 x g、25〜28°Cで、バクテリアがOD₆₀₀が0.5になるまで振とうします。
   4. 100 mLのYESB培地(表1)に1 mLの細菌懸濁液を、同じ選択的抗生物質と共に250 mLのコニカルフラスコで加え、オービタルシェーカーで250 x g、28°Cで4時間振とうします。
   5. 4,000 x gで室温で10分間遠心分離し、細菌を回収します。上清を捨てます。
   6. バクテリアペレットをAAM-AS培地(表1)で再懸濁し、懸濁液をOD600 = 0.4に希釈します><。 手記：細菌懸濁液の完璧なODは、効率的な形質転換に不可欠です。カルス上の過剰な細菌の増殖を排除するのに役立ちます。
   7. ステップ1.1.3から約150個の健康に成長している淡黄色の壊れやすい胚性カリを150mLの滅菌フラスコに集めます。ステップ1.2.6の50〜75 mLの細菌細胞懸濁液を滅菌フラスコに加え、次に10〜25 mLの新鮮なAAM-AS培地を加えて、時々振とうしながらカリを10〜20分間浸します。
   8. フラスコから細菌懸濁液を注意深く注ぎ、滅菌濾紙#1またはティッシュペーパーを使用してカルスから余分な細菌懸濁液を乾燥させます。.次に、滅菌濾紙#1で覆ったNBD-AS培地(表1)を入れたペトリ皿に置きます。暗所で25〜28°Cで3日間インキュベートし、細菌の異常増殖がないか確認します。
3. 耐性カルスの選択
   1. 3日間の共培養後、カリを滅菌フィルターペーパーで滅菌ペトリ皿に移します。
   2. カリを清潔なベンチで2時間風乾します。カルスが濾紙に付着していないことを確認してください。
   3. 滅菌ピンセットを使用して、一次選択培地NBD2(40 mg/Lのハイグロマイシンと250 mg/Lのタイムンを含む)にカリを均等に移します(表1)。カリを25〜28°Cの暗所で2週間培養します。
   4. 2週間後、新鮮な選択培地NBD2(40 mg/Lのハイグロマイシンと250 mg/Lのタイムンを含む)を含む新しいプレートにcalliを均等に移します(表1)。暗所で25〜28°Cでさらに2週間カリを培養します。
4. カルスの分化
   1. カルスを新鮮なMS培地(25 mg/Lのハイグロマイシンおよび150 mg/Lのチメンチンを含む)に移します(表1)。25〜28°Cの光の下で約2週間培養します。
   2. 手順1.4.1をもう一度繰り返します。
   3. 芽芽を新しいMS培地(10 mg / Lのヒグロマイシンを含む)に移して、より多くの芽を増殖させます。

>表1:米の変換のためのメディア組成。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

結果

図 1:カルスを誘導するための出発物質。(A)減数分裂段階の若いイネの花序。(B)NBD2培地で成長している若い花序を解剖した。バー= (A)で2 cm。

図 2:アグロバクテリウム媒介形質転換によるトランスジェニック株の作製手順。(A)若い花序から生成されたイネカリ。(B)カリのサブカルチャー。(C)カリとA.tumefaciensのインキュベーション。(D)カリとA.tumefaciensとの共栽培。(E)ハイグロマイシン(40 mg / L...