エレクトロポレーションを介したIn vitro遺伝子導入:蛍光レポータータンパク質をコードするプラスミドを培養細胞に導入するための電気パルス技術

要約

出典:Lo, J. C. W. et al., Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor.J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNAをマウスの初代小脳顆粒細胞前駆体に導入するエレクトロポレーション技術を実演しています。

プロトコル

1. Hh受容体導入遺伝子過剰発現のエレクトロポレーション:pEGFP-Smo

1. 2 mm ギャップキュベットを使用したエレクトロポレーションでは、エレクトロポレーションの各反応について、1.2 × 10⁶ マウス初代小脳顆粒細胞前駆細胞細胞と 10 μg の pEGFP-mSmo (Tris-EDTA バッファーまたは滅菌 dH₂O 中の DNA ストック濃度を ~2-5 μg/μL に調整) 100 μL の Opti-MEM
   手記：セルが不十分な場合は、総セル数を減らします(ただし、エレクトロポレーション効率が低下する可能性があります)。ただし、プラスミドの量やキュベットごとに使用されるOpti-MEMの総量を調整しないでください。実験に必要な総細胞数が1.5×10⁶細胞を超える場合は、それに応じてエレクトロポレーション混合物をスケールアップし、複数のエレクトロポレーション反応を別々に行ってください。キュベットは最大5回再利用できます。
2. コーティングされたカバースリップを含む24ウェル培養プレートの各ウェルに0.5 mLの培地を加えて、エレクトロポレーション後の細胞播種プレートを調製し、_CO2インキュベーターで37°Cで保温します。細胞接着用のカバースリップを調製するには、オートクレーブ処理した12 mmガラスカバースリップを100 μg/mLのポリ-D-リジン(PDL、滅菌dH₂O中の1 mg/mL)と37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。カバースリップを同じPDL溶液に4°Cで使用まで保管してください。
3. 必要な数の細胞を滅菌済みの1.5mL微量遠心チューブにピペットで移し、室温で200 × gで5分間回転させ、上清を捨て、細胞ペレットを200 μLのOpti-MEMに再懸濁します。Opti-MEMでこのステップを2回繰り返して、チューブ内に残留培地が存在しないことを確認します。
   手記：24ウェルプレートの各ウェル/カバースリップについて、1.2-1.3×10個の⁶細胞/ウェルをエレクトロポレーションしてシードし、培養の翌日に~70-75%の細胞密度を得ます。
4. エレクトロポレーションのパラメータを表1に示すように設定します。
5. エレクトロポレーション反応を穏やかにピペットで動かしてよく混合し、長いP200チップを使用して、混合物の正確な量100μLを2mmギャップキュベットに移します。気泡の形成を避けてください。
6. キュベットをキュベットチャンバーに入れます。
7. エレクトロポレーターのΩボタン(材料の表を参照)を押して、インピーダンス値(~30-35)をメモします。電気インピーダンス値Ωが30〜35の範囲に収まるようにするには、100μLの正確な体積に固着してください。
8. スタートボタンを押してパルスを開始します。
9. 読み取りフレームに表示される測定電流とジュールの値を記録します。
10. キュベットをキュベットチャンバーから取り外します。
11. すぐに100μLの予熱培地をキュベットに加え、ピペッティングで2〜3回穏やかに上下させて再懸濁します。ステップ1.2.
    で調製したコーティングされたカバースリップを含む24ウェルプレートに細胞懸濁液を直ちに移します 手記：細胞死を最小限に抑えるには、エレクトロポレーションの直後に細胞に播種します。
12. CO₂インキュベーターで細胞を37°Cでインキュベートします。細胞の剥離を避けるために、細胞を3時間放置します。
13. 播種後3時間で、上清培地の半分を穏やかに吸引して廃棄し、浮遊する死細胞や破片を取り除き、同量の予熱培地と交換します。
14. 細胞を_CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートします。

	ポーリングパルス設定		トランスファーパルス設定
	マウスプライマリGCP	一次ニューロン	マウスプライマリGCP	一次ニューロン
電圧	275ボルト	275ボルト	20 V	20 V
長さ	1ミリ秒	0.5ミリ秒	50ミリ秒	50ミリ秒
間	50ミリ秒	50ミリ秒	50ミリ秒	50ミリ秒
いいえ。	2	2	5	5
Dレート	10%	10%	40パーセント	40パーセント
極性	+	+	±	±

表1:スーパーエレクトロポレーターNEPA21 TYPEを用いたマウス初代GCPおよび初代神経細胞のエレクトロポレーションパラメータ

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B27サプリメント	ライフテクノロジーズ株式会社	17504044
GlutamMAXTM-I 、100倍	ギブコ、ライフテクノロジーズ	35050061	L-グルタミン代替品
マトリゲル	BDバイオサイエンス	354277	基底膜マトリックス
神経基礎	ギブコ、ライフテクノロジーズ	21103049
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P6407
CU 500キュベットチャンバー	ネパジェネ	CU500
EPAエレクトロポレーションキュベット(2mmギャップ)	ネパジェネ	EC-002
オプティMEM	ライフテクノロジーズ株式会社	31985070	トランスフェクション用の低血清培地
pEGFP-mSmo	アドジーン	25395
スーパーエレクトロポレーター NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo エレクトロポレーション	ネパジェネ	NEPA21	エレクトロポレーター

型