寄生虫形態のヌクレオフェクション:蛍光タンパク質コードプラスミドをスポロゾイト核に送達するためのエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法

要約

出典:Duan, C., et al. Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria parasites. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、蛍光レポータータンパク質をコードするプラスミドDNAをニワトリEimeria寄生虫のスポロゾイト型に送達するエレクトロポレーションベースのトランスフェクション手順であるヌクレオフェクションについて説明します。

プロトコル

1. メロゾイトまたはスポロゾイトの核形成

1. 寄生虫のヌクレオフェクション前の調製
   1. 1本のチューブに約10⁷個のメロゾイトまたはスポロゾイトを準備します。メロゾイトをトランスフェクションする場合は、3〜4本のチューブを調製してください。
   2. プラスミドDNAまたは精製PCRフラグメントを10 μg以上の量
      手記：この研究で使用されたプラスミドには、強化された黄色蛍光タンパク質 (EYFP) とトキソプラズマ原虫 (TgDHFR-TS) に由来するジヒドロ葉酸レダクターゼチミジル酸シンターゼの 2 つの遺伝子が含まれています。
   3. 25Uの制限酵素を調製します。プラスミドが直鎖化されている場合、制限酵素はトランスフェクション効率を向上させることができます。プラスミドが環状の場合は、制限酵素を省略します。
   4. 85 μLのヌクレオフェクション緩衝液を調製します(表1):20 μLのヌクレオフェクション緩衝液Iと1 mLのヌクレオフェクション緩衝液IIを混合し、溶液の一部を使用します。全バッファーの容量は100μLです。
2. ヌクレオフェクション
   1. スポロゾイトまたはメロゾイト懸濁液を600 x gで10分間遠心分離します。次に、上清を捨てます。
   2. 次の順序で、85 μLの核トランスフェクションバッファー、10 μgのプラスミド(PCRフラグメント)、および25 Uの制限酵素(通常は5 μL)を、スポロゾイトまたはメロゾイトを含む1.5 mLチューブに加えます。
   3. 懸濁液を核トランスフェクションカップに移します。カップを核トランスファーグルーブに入れます。
   4. 電源ボタンでヌクレオフェクションデバイスの電源を入れ、トランスフェクション手順U-033を選択します。ヌクレオフェクションデバイスがフリープログラム選択モードで起動した場合は、Xボタンを押してこのモードを終了します。
   5. プログラムが終了したら、ヌクレオフェクションデバイスのXボタンを押すと、ヌクレオフェクションが成功したことを示すOKが画面に表示されます。
   6. ヌクレオフェクションカップに0.5-1mLのダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)を加えて反応を停止させ、穏やかに混合した後、懸濁液を1.5mLチューブに移します。

バッファ	組成
ヌクレオフェクションバッファーI	ATP-二ナトリウム 2g、MgCl2-6H 2O 1.2g、水10 ml
ヌクレオフェクションバッファーII	KH2PO4 6 g、NaHCO3 0.6 g、グルコース0.2 g、水500 ml
*水:蒸留水

>表 1: バッファーの構成。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	マクジーン	CM15019
ヌクレオフェクションデバイス	ロンザ/アマクサ	90900012(ヌクレオフェクターII)
グルコース	シグマ	番号V900116
ATP-二ナトリウム	シグマ	A26209(英語)
セルロース DE-52	ソーラーバイオ	C8350
KH2PO4	シグマ	番号V900041
低速遠心分離機	北京時代北里遠心分離機有限公司	DT5-2
MgCl2	シグマ	449164
NaHCO3	シグマ	144*55*8
PBSの	ソーラーバイオ	P1010
Sorvall Legend Micro 17 微量遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75002430
トリプシン	ソーラーバイオ	T8150
Percoll(DGグラジエントストック溶液)	GEヘルスケア	〒17-0891-09