レンチウイルスベクターベースのペリビテリン注射:目的の遺伝子を受精した単一細胞マウス卵子に形質導入する方法

要約

出典:Dussaud, S. et al., Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、受精マウス胚の周辺空間へのレンチウイルスベクターの核前注入について説明しています。レンチウイルスには導入遺伝子が含まれており、受精胚のゲノムに組み込まれ、最終的にトランスジェニックマウスが生まれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 受精卵から卵丘細胞を取り出します。

1. 実体顕微鏡下で、2つのインスリン注射器を使用します:最初の注射器は卵管を保持するため、もう1つは膨大部を引き裂き、受精卵をヒアルロニダーゼ作業溶液に分散させるため。
2. 卵を採取するために準備したガラスピペットをチューブとマウスピースに取り付けられた0.22μmフィルターに接続して、すべての卵を吸引します。すべての卵を採取し、100μLのM2培地を6滴
連続して洗浄します。
3. 洗浄した受精卵を、M16培地中の雰囲気5%CO₂の加湿37°Cインキュベーターに入れます。

2. インジェクションピペットの作り方

1. 外径1mmの薄肉ガラスキャピラリーチューブ(長さ10〜15cm)を使用し、このキャピラリーを水平マイクロピペットプーラーにクランプします><。 手記：ほとんどの横型ピペットプーラーでは、熱力、引っ張り強度、加熱と引っ張りの間の時間遅延の3つのパラメータを調整できます。これらのパラメータを調整して、図1Aに示すものに似た注入ピペットを取得します。DNAマイクロインジェクションを日常的に行っているユーザーの場合は、標準設定を使用し、加熱と引き抜きの間の遅延を調整して、ピペットチップの全体的な形状を変更します。

3. ホールディングピペットの作り方

1. インジェクティングピペットを使用して、保持ピペットを準備します。
2. マイクロフォージにインジェクティングピペットを取り付けます。マイクロフォージでピペットを切断して、直径80〜100μmの鋭い対称的な先端を取得します。次に、マイクロフォージでチップを熱で研磨して、鋭い生け垣のない対称的な丸い形にします。

4. レンチウイルスベクターを含む注射ピペットの準備

1. レンチウイルスベクター懸濁液を160 x gで2分間遠心分離し、凍結レンチウイルスストックによく存在する破片をペレット化します。
2. 上清を回収し、クラスII安全キャビネット内の新しい0.5mLチューブに移します。
3. マイクロローダーを使用して、ステップ5で説明したように調製したインジェクションピペットに1 μLの上清を移します。
4. インジェクションピペットを右マイクロマニピュレーターのインスツルメントホルダーにセットします。保持ピペットを左のマイクロマニピュレーターに接続します.
   手記： レンチウイルスベクターの形質導入力価は、ファウンダー産生の有効性と直接相関します。高い有効性(>70%)を得るには、100 ngのp24キャプシドタンパク質/μLの範囲に力価を持つウイルスベクターを使用してください。力価を形質導入単位(TU)で表す場合、力価は10⁹ TU/mL以上である必要があります。レンチウイルスベクターストックは、補足法で説明されているように、水疱性口内炎ウイルス(VSV)糖タンパク質-Gをコードするp8.91カプセル化プラスミド、pHCMV-Gを使用して293T細胞を一過性トランスフェクションすることによって産生する必要があります。

5. マイクロインジェクション

1. 8 μLのM2培地をくぼみスライドの中央に分注し、蒸発を避けるために軽いパラフィンオイル(胚試験済み)で覆います。
2. 20個の卵をできるだけ分散しないようにドロップに入れます.
   注意：胚を沈着させるときは泡を作らないでください。
3. インジェクションピペットの先端が開いていることを確認してください。そうでない場合は、保持ピペットでインジェクションピペットを軽くたたきます。
4. マイクロインジェクターを20 s.
   の注入時間に設定します 手記：ウイルス懸濁液の粘度により、ペリビテリン空間におけるウイルスベクターの分散を明確に視覚化できます。注入圧力は、注入から 20 秒以内にスペース全体を満たすように調整する必要があります。これは 10 から 100 pL の体積に相当します。注入圧力は600hPaを超えてはなりません。
5. 2つの前核と2つの極性体を含む1つの受精卵を、実体顕微鏡下の保持ピペットで吸引します。
6. マイクロインジェクターで卵子をペリビテリン腔に注入します.
   注意：インジェクションピペットで原形質膜に触れないでください。
7. 20個の卵のバッチで利用可能なすべての受精卵を注入し、注入した卵をすぐに予熱したM16培地に5%CO₂.
   の雰囲気の加湿37°Cインキュベーターに入れます 手記：注入した卵子を注入後、胚移植前に最低30分間インキュベートします。

結果

図1:マイクロインジェクションピペットの準備とジェノタイピング。
(ア) DNAまたはレンチウイルスベクター注射に使用されるピペットの主な違いを強調するためのマイクロインジェクションピペットの概略図。左のパネル:両方のピペットタイプの全体的な形状が描かれています。破線の円は、ピペットチップの拡大された領域を強調しています。ピペットチップの写真も掲載されています。レンチウイルス注射の場合、点線と対応する写真で示されているように、先端を折る必要があることに注意してください。右パネル:左に保持ピペット、受精卵と注射ピペットを1つの前核またはビテリン周囲空間に設置した卵子注入設定の例。スケールバー = 50 μm. (B) 8つの異なる胚から抽...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
インスリン注射器	VWRの	〒613-3867	テルモ・マイジェクター
校正済みマイクロキャピラリーピペット用のアスピレーターチューブアセンブリ	シグマ	A5177-5EA
ヒアルロニダーゼ酵素30mg	シグマ	H4272-J	マウス胚試験済み
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	ハーバードの装置	GC 100-10
倒立顕微鏡	ニコン	トランスファーマンNK2 5188	ホフマン変調コントラスト照明が必要
マイクロマニピュレーター	エッペンドルフ	セルトラムエア