レーザー支援レンチウイルス遺伝子導入:レンチウイルス遺伝子導入を促進するためにマウス受精卵を透過化する技術

要約

出典:Martin, N. P., et al.マウス受精卵へのレーザー支援レンチウイルス遺伝子送達。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、レンチウイルス遺伝子の送達を促進するためのマウス受精卵の透明帯の保護層のレーザー支援透過を示しています。レンチウイルスは、目的の遺伝子がゲノムに安定して組み込まれたトランスジェニック動物の作製を可能にします。

プロトコル

1. XYClone Laserによるマウス受精卵の穿孔

1. XYCloneレーザーのセットアップとキャリブレーションは、メーカーの推奨に従って行います。他のレーザーは、通常、体外受精に使用されますが、XYCloneレーザーの代わりに受精卵を穿孔することができます。
   1. レーザーコントローラーボックスワイヤーを顕微鏡のレーザー装置に取り付けます。
   2. レーザーコントローラーボックスを、USBポートを介してレーザーソフトウェアを実行しているコンピューターに接続します。3.1.3. レーザーコントローラーを接続し、電源を入れます。
   3. 接眼レンズを通して、テストを穿孔しますamp(スライドガラスのドライイレースマーキングなど)。
   4. 小さなドライバー(レーザーキットに含まれています)を使用して、レーザーのX位置とY位置を顕微鏡の接眼レンズを通して見えるLED光に合わせて調整し、レーザーを校正します。
2. マウスの受精卵が入ったKSOMドロッププレートを顕微鏡ステージに置きます。プレートをインキュベーターの外側に15分以上置かないでください。
3. 顕微鏡の接眼レンズを覗き、胚の透明帯に焦点が合っており、レーザーLED光が見えることを確認します。
4. 顕微鏡ステージを動かして、LEDライト/レーザーでゾナをターゲットにします。
5. コンピュータソフトウェアを使用して、XYCloneレーザーを250μsに設定します。
6. LEDのライトサイズを目的の寸法に調整します(この実験では設定5)。
7. 各受精卵の帯にレーザーで3回穴を開けます。ゾナは、ピアスまたは薄くすることができます。上記の設定を使用すると、レーザーは直径10μmの穴を生成します(図1)
   手記：極体に近づくと、レーザーが胚細胞から遠ざかります。
8. 次のステップに進む前に、組織培養インキュベーターで受精卵を2時間回復させます。

2. XYCloneレーザー穿孔後のマウス受精卵の形質導入

1. 2 μL の濃縮レンチウイルス (1e8 TU/mL 力価以上) を 50 μL KSOM 滴液中にピペットで移します。ピペッティングを上下させないでください。受精卵はピペットの先端に容易に付着します。私たちの経験から、3 μL未満の容量のレンチウイルスの1e5-5e5形質導入単位は、遺伝子導入に最適です。
2. 受精卵がインキュベーターで4日間胚盤胞に成長するのを待ちます。メディアを交換する必要はありません。

3. 形質導入マウス胚の偽妊娠マウスへの非外科的移植

1. 交配の3.5日後に偽妊娠マウスを使用してください。
2. 非外科的胚移植(NSET)デバイスを使用して、マウス胚を偽妊娠マウスに移植します。
   1. 外科用顕微鏡または解剖顕微鏡を使用して、膣鏡を挿入して子宮頸部を視覚化します。
   2. 非外科的胚移植(NSET)デバイスを子宮頸部に約5mm挿入し、胚を約2μLの容量で沈着させます
      手記：滅菌NSETデバイスは、各移送に使用され、手順後に廃棄されます。胚の操作に使用されるすべての試薬は無菌でなければなりません。
3. 2 μL容量のKSOM中の10〜15個の健康な胚盤胞を各偽妊娠マウスに移します。
4. NSETが成功したかどうかを判断するために、次の日で偽妊娠マウスの体重増加を引き続き監視および測定します。.
5. 妊娠中のマウスが自然に出産できるようにするか、胚移植の17日後に帝王切開を行うことにより、子犬を回復させます。帝王切開は、胚が非常に少なく、自然分娩には大きくなりすぎる場合にしばしば必要になります。
6. ジェノタイピングのために子犬から組織を採取し、トランスジェネシスの速度を決定します。

結果

図 1:マウス受精卵のレーザー治療。ゾナに穴を開けて穴を開ける例とゾナを薄くする例。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CD510B-1プラスミド	システムバイオサイエンス	CD510B-1	EF1a-copGFPを発現するレンチウイルスの包装に使用
ジメチルポリシロキサン	シグマ	DMPS5Xの	胚の培養
XYローンレーザー	ハミルトンソーンバイオサイエンス		マウス受精卵の穿孔
非外科的胚移植(NSET)デバイス	パラテック	60010	胚のNSET
KSOMミディアム	ミリポア	MR-020P-5F	胚の培養
KSOMの構成:			mg/100mL
NaCl			555
KClの			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
グルコース			3.6
Na-ピルビン酸			2.2
DL-乳酸、ナトリウム塩			0.174mL
10 mM EDTA			100μL
ストレプトマイシン			5
ペニシリン			6.3
0.5%フェノールレッド			0.1mL
L-グルタミン			14.6
MEM必須アミノ酸			1mL
MEM 非必須 AA			0.5mL
BSAの			100

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