Biolistic-Mediated Gene Transfers:Biolistic Gene Gunを介して標的細胞に目的の遺伝子を送達する技術

要約

出典:Taylor, T., et al. Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、培養細胞におけるバイオリスティック遺伝子銃を介した遺伝子導入のプロトコールを実演します。この方法は、最小限のDNAを使用して安定した遺伝子形質転換の簡単な方法を提供します。

プロトコル

1. DNA調製

1. オレンジ色のマクロキャリアバイオリスティックディスクを鉗子を使用して100%エタノールに浸して調製します。ドライライトが入った大きなシャーレにディスクを入れて乾かします(ドライライトがディスクに触れないように注意してください)。
2. 乾いたら、マクロキャリアディスクをシルバーディスクホルダー(以前は100%エタノールで拭き取っていました)に押し込みます。
3. ボルテックスゴールドマイクロキャリアビーズを100%エタノールに懸濁し、12 μlを1.5 mLの微量遠心チューブに分注します(形質転換ごとに1本のチューブ)。
4. 各チューブに、2 μgのDNA(できれば2 μlの1 μg/μlのDNA)、10 μlの2.5 M CaCl₂、および2 μlの1 Mスペルミジンフリーベースを順に添加します。
5. ステップ1.4のようにネガティブコントロールを設定しますが、DNAは使用しません。
6. 各チューブをボルテックスし、周囲温度で5分間インキュベートします。このインキュベーション中に、各チューブを時々静かにフリックして、沈殿したビーズを再懸濁します。
7. 225 x gでチューブを30秒間スピンさせ、DNAコーティングされた金ビーズをペレット化します。上清を慎重に取り除き(ピペッティングまたは吸引)、廃棄します。
8. 100%エタノール600μlにビーズをゆっくりとピペッティングして完全に再懸濁します。
9. チューブを225 x gで30秒間回転させ、パッキングせずにビーズをペレット化します。上清を慎重に取り除いて捨てます。
10. DNAコーティングされた金ビーズを8 μlの100%エタノールに、ゆっくりとピペッティングして再懸濁します。
11. DNAコーティングされた金ビーズをバイオリスティックディスクの中央に直径1cmピペットで固定し、乾燥させます
    手記：バイオリスティックディスクの中心に見える乾燥した金の円は、十分な濃度の金ビーズが存在することを示しています
    手記：DNAコーティングされた金ビーズを装填したマクロキャリアディスクは、これで遺伝子銃で使用できるようになりました。

>2. 遺伝子銃の操作

1. 真空ポンプをオンにします。
2. 圧力計の圧力が約2,200psiに達するまでノブを反時計回りに回して、ヘリウムガスをオンにします。
3. 左の赤いスイッチを押すと、ジーンガンがオンになります。
4. バキュームとベントの流量を調整して、バキュームが15秒以内に28インチHgに達する
ようにしてください。
5. ラプチャーディスクとマクロキャリアの間の距離が約3/8インチであることを確認してください。
6. エタノールで拭き取ってチャンバー全体を清掃します。
7. ラプチャーディスクを100%エタノールに浸します。滅菌面(ペトリ皿など)で乾燥させます。
8. トルクレンチを使用して、ラプチャーディスクホルダーを緩めます。きれいなラプチャーディスクをホルダーに挿入します。ラプチャーディスクホルダーを元の位置に戻し、トルクレンチで一度右に回して締めます.
   手記：ラプチャーディスクは撮影後に交換されます。
9. メッシュスクリーンを100%エタノールに浸します。滅菌面(ペトリ皿など)で乾燥させます。
10. 乾いたら、洗ったメッシュスクリーンを白いプラスチック製の取り付けプレートに置きます。マクロキャリアディスクホルダーのDNAを下にしてディスクチャンバーに入れます。銀色のキャップをねじ込み、取り付けプレートを最も高いスロットに置きます。
    手記：メッシュスクリーンは撮影のたびに交換されます。
11. 1 Mソルビトールを含むYPD寒天プレートを底板に置きます。
12. チャンバードアを閉め、所定の位置にロックします。
13. 中央の赤いスイッチを押し続けると、真空が作動し、真空が28インチHgに達するまで待ちます。適切な真空レベルに達したら、このスイッチを下の位置に動かします。準備ができたら、右側の赤いスイッチを押し続けて発射します。ラプチャーディスクが弾けたら、すぐに発射ボタンを放し、中央の赤いスイッチを中央の位置に押して、チャンバーを0psiに排出します。
14. 破裂ディスクの破片を取り除き、遺伝子ガンの電源を切ります。次に、ノブを時計回りに回してヘリウムガスをオフにし、最後に真空ポンプをオフにします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.6 μmゴールドビーズ	バイオ・ラッド	〒165-2262	http://www.bio-rad.com
スペルマジンフリーベース	シグマ-アルドリッチ	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
1350 psi ラプチャーディスク	バイオ・ラッド	〒165-2330	http://www.bio-rad.com
画面の停止	バイオ・ラッド	〒165-2336	http://www.bio-rad.com
Macrocarriersディスク	バイオ・ラッド	〒165-2335	http://www.bio-rad.com
PDS-1000/HEシステム	バイオ・ラッド	〒165-2257	http://www.bio-rad.com
Microfuge 18 遠心分離機	ベックマン・コールター	F241.5P	www.beckmancoulter.com