Magnetofection-based transfection In Vitro:磁性ナノ粒子を用いてプラスミドをマウス初代神経細胞に導入する磁場支援技術

要約

出典: Jacquier, A. et al. Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、初代ニューロン細胞培養におけるプラスミドDNAの磁気ガイドトランスフェクションを実演しています。マグネトフェクションは、外部磁場を使用して、磁性ナノ粒子に結合したプラスミドの細胞質への送達をガイドします。

プロトコル

1. ポリオルニチン/ラミニン(Po/L)ディッシュコーティング

>注:ボリュームは24ウェルプレートをコーティングするように適合しています。

1. 必要に応じて、滅菌済みの12mmカバースリップをウェルに入れます。
2. 水に溶かした10 μg/mL Poly-L-Ornithine溶液500 μLでウェルをコーティングします。
3. ウェルを室温で1時間沈殿させます。
4. ポリ-L-オルニチン溶液を取り出し、30分間風乾します。
5. ウェルを37°Cで一晩コーティングし、重炭酸塩L-15.
   中の500μLの3μg/mLラミニンでコーティングします 手記： ウェルは、インキュベーター内で37°Cで7日間保存できます。長時間のインキュベーションでは、ウェル間に滅菌PBSを追加すると、培地の蒸発を防ぐことができます。

2. 運動ニューロンの培養

1. MNを適切な密度、通常は5,000〜10,000個の細胞を24ウェルプレートのウェルあたり500μLの培養培地に希釈します
   手記： 播種密度は、6ウェルプレートで約30,000細胞、96ウェルプレートで約1,500細胞です。
2. P1000でラミニン溶液を取り除きます。
3. 乾燥を避けるために、培地で希釈したMNをすぐにコーティングプレートに移します。
4. 培養物を37°Cで2日間インキュベートします。

3. 運動ニューロンの磁気化

>注:次の手順では、使用される量は24ウェルプレートの1ウェルのトランスフェクション用です。別の形式については、製造元のプロトコルを参照してください。

1. DNA調製では、1 μgのDNAを50 μLの神経培養培地に再懸濁し、ボルテックスで5秒間浸します。ここでは、ニューロフィラメントcDNAを制御するCAGGSプロモーター(pCAGEN)を持つ9kbプラスミドを使用します。
2. ビーズチューブの調製には、1.5 μLのビーズを50 μLの神経細胞培養培地に再懸濁します。
3. 50 μL ビーズ溶液を 50 μL DNA 溶液に加え、室温で 20 分間インキュベートします (総容量 = 100 μL)。
4. このインキュベーション中に、トランスフェクションするウェルから100 μLの培地を引き出します
   注:磁気プレートをインキュベーターに入れて37°Cに温めます。
5. DNA/ビーズミックス100 μLをウェルに移し、プレートを磁気プレート上で37°Cで20〜30分間インキュベートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プラスミドpCAGEN	アドジーン	#11160
ニューロン細胞培養液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A3582901	ニューロバサルプラスミディアム
ポリ-DL-オルニチン	シグマ・アルドリッチ	P8638
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020
炭酸水素ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25080094
L-15ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11415056
PBSとCa Mgなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190144	Mg2+ Ca2+ なし
丸型カバースリップ	NeuVitro、ニットガラス	GG-12-プレ	12ミリメートル