レトロウイルス媒介遺伝子導入:遺伝子組換えレトロウイルスベクターを用いて培養細胞に導入遺伝子を導入するための遺伝子導入技術

要約

出典: Jacquier, A. et al. Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、初代ニューロン細胞培養におけるプラスミドDNAの磁気ガイドトランスフェクションを実演しています。マグネトフェクションは、外部磁場を使用して、磁性ナノ粒子に結合したプラスミドの細胞質への送達をガイドします。

プロトコル

1. レトロウイルスコンストラクトの準備

1. T細胞受容体(TCR)のα鎖およびβ鎖を2Aリンカーで分離し、MSCVベースのレトロウイルスベクター(pMIAIIまたはpMIGIIなど)にサブクローニングします
   手記：2Aリンカーは、単一のオープンリーディングフレームからアルファおよびベータTCR鎖の化学量論的および一致的な発現を可能にします。このベクターには、形質導入細胞と形質導入効率を追跡するために使用されるIRES蛍光タンパク質カセット(アメトリンまたはGFP)が含まれています。
2. 市販の血漿調製キットまたは類似の製品を使用してプラスミドDNAを単離します。1-2 μg ^μl-1の使用濃度を使用してください。

2. レトロウイルス産生細胞株の作製

1. 2段階のプロセスを利用して、レトロウイルス産生細胞株を作製します。
   1. 293T細胞に3つのプラスミド(pVSVG、pEQ-Pam3(-E)、目的ベクター)を一過性トランスフェクションしてレトロウイルスを作製し、293T細胞からレトロウイルス上清を採取してGP+E86エコトロピックレトロウイルス産生細胞株に形質導入します。
   2. 蛍光発現GP+E86産生細胞の上位40%をFACSによ....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM、高グルコース+グルタミン	コーニングセルグロ	10-013-履歴書	4.5 g/Lグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムによるイーグルの培地のダルベッコの改質
FBSの	アトランタバイオロジカル	S11550
トリプシン-バーセン	ロンザ	17-161階
0.45 μm シリンジフィルター	サーモサイエンティフィック	〒194-2545
ポリブレン	シグマ	H9268-10G(英語版)	dH2Oでろ過された滅菌
シプロフロキサシン	VWRの	AAJ61970-06
ピルビン酸ナトリウム	コーニングセルグロ	25-000-CI
MEM非必須アミノ酸	コーニングセルグロ	25-025-CIの
HEPES 1 Mソリューション	コーニングセルグロ	25-060-CIの
L-グルタミン	コーニングセルグロ	25-005-CIの
150 mm組織培養皿	グライナーバイオワン	639160
ティスエ培養処理された6ウェルフラットプレート	グライナーバイオワン	657160
70 μm ナイロンセルストレーナー	隼	352350
マウスIL-3	インビトゲン	PMC0033
ヒトIL-6	インビトゲン	PHC0063
マウス幹細胞因子	インビトゲン	PMC2113L
10倍PBS	コーニングセルグロ	46-D13-CM
HANKSバッファ	コーニングセルグロ	21020147
BD 10 ml シリンジ	BDの	300912
BD 1 ml シリンジ	BDの	309659
27 G x 1/2 BD精密グライドニードル	BDの	305109
30 G x 1/2 BD精密グライドニードル	BDの	305106