レトロウイルス媒介遺伝子導入:遺伝子組換えレトロウイルスベクターを用いて培養細胞に導入遺伝子を導入するための遺伝子導入技術

要約

出典: Jacquier, A. et al. Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、初代ニューロン細胞培養におけるプラスミドDNAの磁気ガイドトランスフェクションを実演しています。マグネトフェクションは、外部磁場を使用して、磁性ナノ粒子に結合したプラスミドの細胞質への送達をガイドします。

プロトコル

1. レトロウイルスコンストラクトの準備

1. T細胞受容体(TCR)のα鎖およびβ鎖を2Aリンカーで分離し、MSCVベースのレトロウイルスベクター(pMIAIIまたはpMIGIIなど)にサブクローニングします
   手記：2Aリンカーは、単一のオープンリーディングフレームからアルファおよびベータTCR鎖の化学量論的および一致的な発現を可能にします。このベクターには、形質導入細胞と形質導入効率を追跡するために使用されるIRES蛍光タンパク質カセット(アメトリンまたはGFP)が含まれています。
2. 市販の血漿調製キットまたは類似の製品を使用してプラスミドDNAを単離します。1-2 μg ^μl-1の使用濃度を使用してください。

2. レトロウイルス産生細胞株の作製

1. 2段階のプロセスを利用して、レトロウイルス産生細胞株を作製します。
   1. 293T細胞に3つのプラスミド(pVSVG、pEQ-Pam3(-E)、目的ベクター)を一過性トランスフェクションしてレトロウイルスを作製し、293T細胞からレトロウイルス上清を採取してGP+E86エコトロピックレトロウイルス産生細胞株に形質導入します。
   2. 蛍光発現GP+E86産生細胞の上位40%をFACSにより単離し、形質導入-GP+E86産生細胞をウイルスの供給源として増殖させる
      手記：高力価の産生者の創出は、骨髄細胞の効率的な形質導入にとって重要です。

3. レトロウイルスを介した幹細胞遺伝子導入 (-5日目)

1. 各GP+E86産生細胞株の0.5 -1.0 x 10⁶を完全なDMEM 10%(vol/vol)FBSで解凍し、培養して、このプロトコルの0日目までに2つのコンフルエント150 mmプレートに十分な増殖を可能にします
   手記：各GP+E86産生細胞株を10 cmプレートで0.5 - 1.0 x 10⁶で解凍すると、5日目に30 - 50%のコンフルエントが得られます。これにより、GP+E86産生細胞株を0日目までに2つのコンフルエント150mmプレートに拡大するために、5日間の培養も可能になります。
   1. マイコプラズマ汚染を避けるために、5%ウシ胎児血清とシプロフロキサシン(10 μg/ml)を含む全組織培養培地でレトロウイルス産生細胞株を培養します><。 手記：骨髄形質導入のためのウイルス上清を生成するときは、シプロフロキサシンの使用を中止してください。.産生細胞株の過剰増殖は、骨髄形質導入効率に悪影響を与えるため、避けてください。

>4. レトロウイルス産生細胞培養 (0日目)

1. プレート 3 x 10 150 mm プレートあたり⁶ レトロウイルス産生細胞、18 ml 完全 DMEM 20% (vol/vol) FBS。
2. レトロウイルス産生細胞を37°Cで一晩インキュベートします。150 mmプレート1枚で1,500万個の骨髄細胞(約2〜3匹のドナーマウス)を予想してください。

5. レトロウイルス上清 (1日目)

1. 翌日(約24時間後)に、10 mLのシリンジで150 mmプレートから直接レトロウイルス上清を吸い上げ、0.45 μmシリンジフィルターでろ過することにより、プロデューサープレート(ステップ4で設定)からレトロウイルス上清を回収します。
2. 除去したレトロウイルス上清を18 mLの新鮮で完全なDMEM 20%(vol / vol)FBSと慎重に交換します。.
3. ろ過されたレトロウイルス上清にIL-3(20 g ^ml-1)、IL-6(50 g ^ml-1)、MSCF(50 g ^ml-1)、および臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン)(6 μg ^ml-1)を補充します
   手記：臭化ヘキサジメトリンは、レトロウイルス形質導入の有効性の低下を避けるために、2か月ごとに新鮮にする必要があります。.

6. レトロウイルス上清と形質導入 (2日目)

1. 24時間後、ウイルス産生細胞株から新鮮なウイルス上清を回収します。10 mLシリンジと0.45 μmシリンジフィルターを使用してレトロウイルス上清をろ過します。ろ過されたレトロウイルス上清にIL-3(20 g ^ml-1)、IL-6(50 g ^ml-1)およびSCF(50 g ^ml-1)、および臭化ヘキサジメトリン(6 g ^ml-1)を補充します。.
2. 次に、骨髄細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルからピペットで慎重に取り出すか、上部2mlの培地を吸引します
   手記：通常、井戸の中央に集中している骨髄を吸引しないように注意して作業します。あるいは、除去した上清をスピンダウンして、失われた骨髄細胞を回復させることもできます。
3. 骨髄の6ウェルプレートの各ウェルに、サイトカインと臭化ヘキサジメトリンを含む新鮮なウイルス上清3 mLを加えます。プレートをプラスチックで包み、1,000 x gでスピン導入を60分間、37°Cで繰り返し、プレートを開封し、細胞を37°Cおよび5%_CO2で一晩(約24時間)インキュベー
トします。

>7. 新しいサプリメントDMEMの追加(3日目)

1. 24時間後、ステップ6.2のように、骨髄細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルから上部2 mLの培地を取り出します。取り外した培地を、最終濃度のIL-3(20 g ^ml-1)、IL-6(50 g m^l-1)、SCF(50 g ^ml-1)を添加した新しいDMEM 20%(vol/vol)FBSと交換します。
2. 骨髄プレートを37°Cの_CO2インキュベーターでさらに24時間インキュベートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM、高グルコース+グルタミン	コーニングセルグロ	10-013-履歴書	4.5 g/Lグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムによるイーグルの培地のダルベッコの改質
FBSの	アトランタバイオロジカル	S11550
トリプシン-バーセン	ロンザ	17-161階
0.45 μm シリンジフィルター	サーモサイエンティフィック	〒194-2545
ポリブレン	シグマ	H9268-10G(英語版)	dH2Oでろ過された滅菌
シプロフロキサシン	VWRの	AAJ61970-06
ピルビン酸ナトリウム	コーニングセルグロ	25-000-CI
MEM非必須アミノ酸	コーニングセルグロ	25-025-CIの
HEPES 1 Mソリューション	コーニングセルグロ	25-060-CIの
L-グルタミン	コーニングセルグロ	25-005-CIの
150 mm組織培養皿	グライナーバイオワン	639160
ティスエ培養処理された6ウェルフラットプレート	グライナーバイオワン	657160
70 μm ナイロンセルストレーナー	隼	352350
マウスIL-3	インビトゲン	PMC0033
ヒトIL-6	インビトゲン	PHC0063
マウス幹細胞因子	インビトゲン	PMC2113L
10倍PBS	コーニングセルグロ	46-D13-CM
HANKSバッファ	コーニングセルグロ	21020147
BD 10 ml シリンジ	BDの	300912
BD 1 ml シリンジ	BDの	309659
27 G x 1/2 BD精密グライドニードル	BDの	305109
30 G x 1/2 BD精密グライドニードル	BDの	305106