オイルレッドO染色:in vitroで肝脂肪症を検出するための肝細胞中性脂質染色技術

要約

出典: Campos-Espinosa, A. et al., A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、脂肪肝や肝臓への過剰な脂肪蓄積を検出するために、肝細胞の中性脂質をin vitroで染色する様子を実演しています。過剰な脂肪は、脂肪滴の形で細胞内に蓄積されます。オイルレッドOは、これらの脂肪滴中の細胞内中性脂質に結合する脂溶性色素です。光学顕微鏡で観察すると、これらの細胞内脂肪滴は濃い赤色に見えます。

プロトコル

1. Oil-Red Oによる脂質染色

1. 細胞培養カバースリップを24ウェルプレートのすべてのウェルに入れます。
2. ウェルあたり100,000個のHepG2細胞を播種します。標準 RPMI 1640 1 mL を添加します。
3. 37°Cおよび5%CO2で24時間プレインキュベー
トします。
4. 標準 RPMI 1640 培地をステトジェニック培地に変更します。
5. 24時間、2日、3日、および4日間インキュベートし、24時間ごとに脂肪原性培地をリフレッシュします。
6. 適切な時間が経過したら、上清を捨てます。
7. 1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。上清を捨てます。
8. PBS中の4%パラホルムアルデヒド1mLで固定します。
9. 室温で1時間インキュベートします。
10. 余分なパラホルムアルデヒドを捨てます。
11. 細胞を1 mLの蒸留水ですすいでください。
12. 70%イソプロパノール1mLを加え、5分間インキュベートします。
13. 余分なイソプロパノールを廃棄します。.この時点ではPBS洗浄は必要ありません。
14. 1 mLのOil-red O溶液を加え、30分間インキュベートします。
15. 余分なオイルレッドO溶液を廃棄します。
16. 1mLの蒸留水ですすいでください。
17. 500 μLのヘマトキシリン溶液を加えます。3分間インキュベートします。
18. 余分なヘマトキシリン溶液を廃棄します。.
19. 1mLの蒸留水ですすいでください。
20. 顕微鏡で400倍(対物レンズ40倍、接眼レンズ10倍)で観察します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
培養培地 RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco社(米国)	〒31800-022	-
ウシ胎児血清(FBS)	ThermoFisher-Gibco社(米国)	A4766801	-
HepG2細胞株	ATCC, アメリカ	HB-8065	肝細胞癌ヒト細胞。
加湿インキュベーター	サーモエレクトロニックコーポレーション、米国	モデル:3110	温度 (37 °C ± 1 °C)、湿度 (90% ± 5%) 、CO2 (5% ± 1%)
倒立顕微鏡 Eclipse	ニコン	モデル:TE2000-S	-
イソプロパノール	Sigma-Aldrich(米国)	I9030-4L	-
オイルレッドOキット	アブカム, アメリカ	AB150678 (英語	中性脂肪の組織学的視覚化のためのキット。
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich(米国)	P6148-500Gの	-
ペニシリン/ストレプトマイシン	ThermoFisher-Gibco社(米国)	15140-122	抗生物質 10,000 U/mL ペニシリン、10,000 μg/mL ストレプトマイシン
リン酸緩衝生理食塩水	ThermoFisher-Gibco社(米国)	〒10010-023	-
セロロジカルピペット	ザルシュテット(オーストラリア)	86.1253.001	非発熱性、滅菌、5 mL
セロロジカルピペット	ザルシュテット(オーストラリア)	86.1254.001	非発熱性、滅菌、10 mL
炭酸水素ナトリウム	Sigma-Aldrich(米国)	S5761-1KGシリーズ	培地の調製
オレイン酸ナトリウム	サンタクルーズバイオテクノロジー、米国	SC-215879Aの	-
パルミチン酸ナトリウム	サンタクルーズバイオテクノロジー、米国	SC-215881	-
トリプシン 0.05% /EDTA 0.53 mM	コーニング, アメリカ	25-052-CL	-
24ウェル細胞培養クラスター	コーニング, アメリカ	3524	蓋付きの平底。組織培養処理済み。非発熱性、ポリスチレン、滅菌済み。1 /パック。

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