ナイルレッド染色:藻類中の細胞内中性脂質を検出および定量する技術

要約

出典:Storms, Z. J. et al.蛍光を使用して藻類細胞の中性脂質を測定するためのシンプルで迅速なプロトコル。J. Vis. Exp.(2014年)

このビデオでは、藻類細胞の中性脂質をナイルレッド色素で染色することにより、検出および定量するためのプロトコルを示しています。

プロトコル

>1. ナイルレッドを用いた中性脂質の蛍光定量

>注:蛍光の読み取りには、5 g/Lの藻類懸濁液10 μlのみが必要です。一般に、1.5mlの培養液からの乾燥藻類バイオマスの単離は十分すぎるほどです。また、分光光度計のランプの光強度は、時間の経過とともに低下する可能性があります。装置の変動が測定値に不必要な誤差をもたらさないように、すべての実験に標準物質を含めることをお勧めします。

1. アルコール試薬グレードのエタノールに溶解した10μg/mlの濃度のナイルレッド溶液を調製します。この溶液は、4°Cの暗所で保存してください。
2. 脱イオン水に30%(v / v)エタノール溶液を調製し、4°Cで保存します。
3. すべての藻類サンプルを同じバイオマス濃度(5 g / Lを推奨)で、測定に使用した標準と同じ方法で調製します。これを行うには、事前に乾燥させたサンプルを適切な量のリン酸緩衝液(0.6 g/L リン酸二塩基性カリウム、1.4 g/L リン酸一塩基性カリウム)に懸濁するか、濁度を測定した後、増殖中の藻類培養液をリン酸緩衝液で 5 g/L に調整します
   注:生きた藻類培養物で行われた測定は、濁度検量線の精度に応じて、それらに関連する誤差が大きくなることがよくあります。乾燥サンプルを再懸濁するには、バイオマスを完全に分散させるためにホモジナイザーを使用する必要がある場合があります。
4. 各サンプルについて、80 μlの30%エタノール溶液、10 μlのNile Red溶液、および10 μlの藻類懸濁液を96ウェルプレートの1ウェルに混合します。蛍光測定のばらつきを適切に考慮するために、各サンプルを5回繰り返します。
5. 標準試料を用いて2点検量線を算出し、装置や調製の日々の変動を考慮します。蛍光測定用のスタンダードをサンプルと同じ手順で調製します.
   注:通常、機器の再校正には2ポイントで十分ですが、直線性を確認するために3ポイントを実行できます。
6. 蛍光測定は、マルチウェルプレートリーダー分光光度計で行います。以下の条件が最も一貫した結果をもたらすことがわかりました。
   1. 1,200 rpm、軌道3 mm、30秒間振とうします。
   2. 40°Cで10分間インキュベートします。
   3. 1,200 rpm、軌道3 mm、30秒間振とうします。
   4. 記録的な蛍光、530 nmでの励起、604 nmでの発光。
7. 内部標準からの結果を使用して、蛍光測定値を油分に変換します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
25mlの使い捨てピペット	漁夫	13-676-10K
ピペットバルブ	漁夫	13-681-51
1.5 ml微量遠心チューブ	漁夫	05-408-129
40 ml遠心分離チューブ(FEP)	漁夫	05-562-16A	ガラス管も使用できます
パスツールガラスピペット	漁夫	13-678-20C
ナイルレッド	シグマ	N3013-100MG
エタノール(アルコール試薬グレード)	漁夫	AC65109-0020
Leica DMRXA2 (または同等品) 顕微鏡	ライカ	DMRXA2
蛍光マルチウェルプレートリーダー	Thermo Labシステム	フルオロスカン アセン
蛍光リーダーソフトウェア	Thermo Labシステム	アセントソフトウェア2.6
丸底のCOSTAR 96ウェルプレート	漁夫	06-443-2