大動脈血管平滑筋細胞のフォンコッサ染色:動脈内側層石灰化の評価のためのインビトロ技術

要約

出典:O'Rourke, C., et al.血管平滑筋細胞の石灰化と大動脈石灰化および炎症のイメージング。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、in vitroで血管平滑筋細胞の動脈内側石灰化を評価するための染色技術を示しています。フォンコッサ法は、光化学反応を利用して石灰化部位に金属銀を堆積させ、黒色を付与します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 試薬の調製

1. マウス大動脈VSMCの分離と石灰化
   1. 大動脈消化液:
      1. 175 U/ml 2 型コラゲナーゼと 1.25 U/ml エラスターゼを含む Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) を使用して、新鮮な溶液 (採取した大動脈あたり ~3-5 ml) を準備します。0.22 μmの真空駆動ろ過システムで溶液を滅菌し、使用するまで溶液を氷上に保ちます。
   2. 細胞培地:
      1. 500 mlのダルベッコのモディファイドイーグルメディウム(DMEM)に10%ウシ胎児血清、100ユニット/ mlペニシリン、および100μg / mlストレプトマイシンを補給します。.使用前にメディアを37°Cに温めてください。
   3. 石灰化培地:
      1. 石灰化培地A(NaPhos;マウス細胞株に使用):
         1. 100〜500 mlのDMEM(必要に応じて容量)に10%ウシ胎児血清、2 mMリン酸ナトリウム、100単位/ mlペニシリン、および100 μg / mlストレプトマイシンを補給します。.使用前にメディアを37°Cに温めてください.
            又は
      2. 石灰化培地B(βGP/Asc/DEX;マウスまたはヒト細胞株のいずれかで使用):
         1. 100〜500 mlのDMEM(必要に応じて容量)に、10%ウシ胎児血清、10 mM β-グリセロリン酸二ナトリウム、50 μg / mlのL-アスコルビン酸、10 nMデキサメタゾン、100 units / mlペニシリン、および100 μg / mlストレプトマイシンを補給します。.使用前にメディアを37°Cに温めてください。

2. マウスの解剖

1. 200 mg / kg腹腔内ペントバルビタール注射でマウスを安楽死させます。.
2. 動物を仰臥位で解剖ボードに置き、各足をボードにテープで固定して安定させます。解剖顕微鏡と小さなハサミを使用して、下腹部から胸部上部まで正中線を切開します。
3. 鉗子で皮膚をはがし、腹膜を取り除き、腹部の臓器を露出させます。大動脈を横断しないように注意しながら、胃腸器官を切除します。
4. 前横隔膜を横方向に切開し、腹部を横切って切開を続けます。解剖ハサミを使用して、肋骨の側面を切り取り、胸骨の上部に付着している軟組織を取り除き、胸郭を解放します。胸郭を取り外し、肺を露出させます。
5. 最初に心臓を所定の位置に置いたままにし(近位大動脈の特定と解剖を支援するため)、肺を慎重に取り除きます。胸腺、気管、食道を慎重に取り除き、大動脈が無傷のままであることを確認します。
6. まっすぐな細い鉗子とマイクロ解剖ハサミを使用して、腸骨分岐部から大動脈弓までの大動脈周囲の軟組織を切除し、大動脈周囲脂肪を除去する際には細心の注意を払います(図1A)。大動脈弓の大きな枝を囲む残りの脂肪と軟組織(すなわち、腕頭動脈、総頸動脈および鎖骨下動脈、図1B)
   手記：蛍光イメージングを行う際には、脂肪がバックグラウンドシグナルを増加させる可能性があるため、大動脈から脂肪を除去することが重要です。
7. 心臓を胸腔から取り出し、近位大動脈から慎重に取り外して廃棄します。腸骨分岐部で遠位大動脈を横断します。インスリン針を使用して、大動脈弓から大動脈に生理食塩水を注入し、残りの血液細胞を洗い流します。大動脈を大動脈弓血管と一緒に切り離し、体から完全に取り除きます。
8. イメージングの準備ができるまで、大動脈を氷上の通常の生理食塩水に置きます。

>3. 初代マウス大動脈血管平滑筋細胞の単離

1. 解剖が完了するまで、冷たいHBSSに大動脈を置きます。残っている大動脈周囲脂肪と軟組織を慎重に切り取り、大動脈だけを残します。
2. 滅菌組織培養フードの下で、35 mm x 10 mmの組織培養皿で大動脈消化液に大動脈を移します。37°Cのインキュベーターに30分間置き、間欠的に静かに揺さぶります。消化後、大動脈は伸びたり擦り切れたりした外観を示します。
3. 解剖顕微鏡と滅菌鉗子を使用して、内側層を無傷に保ちながら、大動脈の外側外膜膜層を取り除きます。外膜を取り除くための1つの技術は、大動脈の一端の外層を剥がし、靴下を剥がして取り除くことができるように、その下の内側層からそれを取り除くことです。
4. 外膜層が除去されたら、残りの大動脈を細胞培養培地と共に新しい組織培養皿に入れ、5%_CO2で37°Cで2〜4時間保存します。
5. 滅菌フードの下で、滅菌済みの3mmマイクロダイセクションハサミを使用して、大動脈を1〜2mm幅のリングに切断します。
6. これらのリングを大動脈消化液を入れた新しい組織培養皿に入れ、37°Cで120分間穏やかに断続的に揺さぶってインキュベートします。このインキュベーション中に溶液を数回上下にピペットで動かして細胞を再懸濁します。
7. 5 mLの温細胞培養培地を消化溶液に加え、15 mLのコニカルチューブに移します。
8. チューブを200 x gで5分間遠心分離します。
9. 培地を吸引し、細胞を所望の量の細胞培養培地(例えば、5 mL)に再懸濁します。
10. 各大動脈から単離した細胞の全量を25 cm²細胞培養フラスコに播種し、5% CO₂ で 37 °C でインキュベートします。前述したように、標準的な手法を用いて細胞を増殖させます。インキュベーションの最初の7〜10日間は、72〜96時間ごとに培地を交換してください。細胞がコンフルエンスに近づくにつれて、培地をより頻繁に(48時間ごと)補充します
    手記：十分な量の細胞を増殖させるには、数週間かかる場合があります。
11. コンフルエントになったら、37^°Cに温めたトリプシンで細胞を継代します^。
    1. 各培養フラスコに0.5〜1.0 mLのトリプシンを加え、3〜5分間インキュベートし、必要に応じてフラスコの側面を30〜60秒ごとに軽くたたいて、表面から細胞を剥離します。
    2. 細胞がフラスコの底から分離したら、トリプシン中の細胞に10mlの細胞培地を加えます。細胞を200 x gで5分間遠心分離します。細胞ペレットから培地とトリプシンを吸引します。細胞を所望の量の新鮮細胞培地(例えば、5〜10 mL)に再懸濁し、新しいフラスコに移します(一部の細胞をチャンバースライドに移します)。
12. 細胞の最初の継代では、前述のように、α平滑筋アクチンに対する抗体を使用して、標準的な免疫細胞化学技術で平滑筋細胞の系統を確認します。

4. 培養平滑筋細胞の石灰化

誘導

1. 3.12から6ウェル形式で得られたプレートセル.
   手記：1 x 10⁵細胞/ウェルから開始し、ウェルあたり総量2.0 mLの細胞培地を使用することを推奨します。
2. 6ウェルプレート形式で、石灰化培地AまたはBで細胞を少なくとも7日間増殖させます。細胞を37°Cで5%_CO2とインキュベートします。
3. セルメディアは48時間ごとに交換します。

>5. von Kossa染色法によるVSMC石灰化の評価

>注:組織または培養細胞の細胞外マトリックス石灰化を測定するためのフォンコッサ法は、リン酸結合カルシウムイオンを銀イオンで置換することに基づいています。光と有機化合物の存在下では、銀イオンは還元され、金属銀として視覚化されます。未反応の銀は、チオ硫酸ナトリウムで処理することにより除去されます。フォンコッサ染色のプロトコルは次のとおりです。

1. 細胞培養プレートから培地を吸引します。
2. 細胞を10%ホルマリン1 mLに室温で20分間入れて固定します。
3. ホルマリンを除去し、固定細胞を蒸留水で5分間洗浄します。
4. 細胞を5%硝酸銀溶液1 mLに溶かし、60〜100 Wの球根で1〜2時間インキュベー
トします。
5. 硝酸銀溶液を吸引し、蒸留水で5分間洗浄します。
6. 細胞を蒸留水中の5%チオ硫酸ナトリウム(w / v)溶液1 mLに5分間入れて、未反応の銀を除去します。
7. 細胞を蒸留水で5分間すすぎ、洗浄を3回繰り返します。フォンコッサ染色剤は、標準的な倒立光学顕微鏡でイメージングする準備ができています。
8. オプションステップ:1mlの耐核レッドで5分間対比染色し、その後、蒸留水で3回洗浄します(各5分間)。

結果

図1:野生型マウスによる大動脈の代表的な解剖 (A)胸部と腹部の大動脈が総腸骨動脈の分岐部まで伸びている写真は、上にある臓器と大動脈周囲脂肪を除去した後に描かれています。(B)腕頭動脈、左総頸動脈、および左鎖骨下動脈を備えた大動脈弓の焦点を合わせた図。スケールバー= 1 mm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15mlコニカルチューブ	隼	352096
アルファ平滑筋アクチン抗体	シグマ	SAB2500963
チャンバースライド	Nuncラボテック	154461
コラゲナーゼ、タイプ2	ワージントン	LS004176
デキサメタゾン	シグマ	D4902
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	ライフテクノロジー	11965-084
エラスターゼ	シグマ	E1250
ウシ胎児血清	ギブコ	16000-044
鉗子、細かい点	ロボズ	RS-4972
鉗子、全曲線鋸歯状	ロボズ	RS-5138
ホルマリン(10%)	電子顕微鏡科学	15740
ハンクのバランスの取れた塩溶液	ギブコ	14025-092
針付きインスリン注射器	テルモ	SS30M2913
L-アスコルビン酸	シグマ	A-7506
マイクロ解剖スプリングハサミ(13mm)	ロボズ	RS-5676
マイクロ解剖スプリングハサミ(3mm)	ロボズ	RS-5610
通常の生理食塩水	ホスピーラ	0409-4888-10
核ファストレッド	シグマ・アルドリッチ	N3020
ペニシリン/ストレプトマイシン	コーニング	30-001-CIの
硝酸銀(5%)	リカ化学工業株式会社	6828-16
リン酸ナトリウム二塩基性七水和物	シグマ・アルドリッチ	S-9390
チオ硫酸ナトリウム	シグマ	S-1648
ẞ-グリセロリン酸二ナトリウム塩水和物	シグマ	G9422
組織培養フラスコ、25 cm2	隼	353108
組織培養プレート(35 mm x 10 mm)	隼	353001
組織培養プレート、6ウェル	隼	353046
トリプシン	コーニング	25-053-CIの
真空駆動ろ過システム	ミリポア	SCGP00525

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