TEMグリッド上のウイルスサンプルのカプセルベースのネガティブ染色:エンベロープウイルスの超微細構造を可視化するための重金属染色技術

要約

出典:Blancett, C. D., et al.生物学的封じ込め内のウイルスサンプルの陰性染色のためのカプセルの利用。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、バイオコンテインメント環境内で処理カプセルを使用して、エンベロープウイルスサンプルのネガティブ染色を実演します。ネガティブに染色されたウイルスは、透過型電子顕微鏡を使用して視覚化し、ナノメートルの分解能でウイルスの構造と形態を調べることができます。

プロトコル

1. BSL-2実験室における2%グルタルアルデヒドによる生物学的封じ込めの不活化とそれに続く陰性染色のためのカプセル法

1. ウイルスの不活化手順。
   1. 生物学的封じ込めBSC内で、ウイルス懸濁液を同量の4%グルタルアルデヒドとよく混合して、最終濃度の2%グルタルアルデヒドを達成します
      注意：グルタルアルデヒドは危険な化学物質であり、適切な保護が必要です。グルタルアルデヒドは通常のBSCで短時間使用できますが、拡張オープン試薬はダクト付きBSCまたは化学ヒュームフードでの作業が必要です。
   2. ウイルスを固定剤で最低24時間不活化してから、包装、除染、BSL-2 EM施設に移します。
2. BSL-2 EM施設では、ウイルスと固定剤の混合物を、ピペットに取り付けられた2つのTEMグリッドを含むカプセルに吸引します。
3. グリッドを水平に向け、ピペットを水平に10分間置きます。
   手記：これは、TEMグリッド上にウイルス粒子が均一に分布するようにするためです。
4. ピペットを手に取り、プランジャーを押し下げてウイルスを廃棄物容器に排出します。40 μLのdI水をカプセルに吸引し、廃棄物容器に3回のすすぎサイクルで排出します。
5. 1%酢酸ウラニル(UA)または1%リン酸カリウム(PTA)のいずれか40μLをカプセルに吸引し、30 s.
   手記：染色時間は、ウイルスサンプルに基づいて 10 秒から 1 分まで変化しました.
   注意：UAはアルファエミッターであり、累積毒素です。適切な保護で取り扱ってください。
6. ピペットからカプセルを取り出し、グリッドの端を濾紙に触れてグリッドを拭き取り、乾燥させます。グリッドを風乾し、その後のTEMイメージングのために保管します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Formvar/カーボンコーティングTEMグリッド	SPIの	3420C-メガバイト	200メッシュCu Pk / 100
mPrep/gカプセル	EMSの	85010から01	箱
mPrep/fカプラー	EMSの	85010-11	スタンダード 16/パック
グルタルアルデディデ	EMSの	16320	50%溶液、EMグレード
酢酸ウラニル	EMSの	22400	粉
カリウムリンタングステン酸	EMSの	19500	粉
濾紙	ワットマン	1450-090	サイズ 50
トランミッション電子顕微鏡	日本電子	JEM-1011	TEM