軟組織サンプルのエオシン染色:特定の組織微細構造を視覚化するためのマウス腎臓全染色のためのエオシンベースの手順

要約

出典:Busse, M. et al., 3D Imaging of Soft-Tissue Samples using an X-ray Specific Staining Method and Nanoscopic Computed Tomography.J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、マウスの腎臓全体を酸性化し、固定した後にエオシンYを染色する手順を示しています。この細胞質特異的なエオシン染色法は、組織内の解剖学的構造を可視化し、同定するのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. エオシン染色プロトコール

1. 軟部組織サンプルを固定するには、9.5 mL の 4% (v/v) ホルムアルデヒド溶液 (FA) と 0.5 mL の氷酢酸 (AA) を含む 9.5 mL の固定溶液を 50 mL 遠心分離チューブに充填します
   手記：約10%メタノールで安定化した37%アシッドフリーのFA溶液からFA溶液を新たに調製します。FA溶液をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でさらに希釈します。カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSを選択してください。希薄なFA溶液は1ヶ月以内に保管してください。酸性化中、固定液のpHは中性から約3.
   に変化します 注意：FAは急性臓器毒性、腐食性、発がん性があるため、ドラフトの使用が義務付けられており、適切な保護個人用機器を使用する必要があります。
   1. 取り除いたばかりの軟部組織サンプルを50 mL遠心チューブに加え、50 mL遠心チューブを24〜72時間冷蔵します< / > 手記：ここでプロトコルを一時停止できます。
   2. 軟部組織サンプルをDPBS溶液で1時間洗浄します。
2. 固定した軟組織サンプル(例:マウス腎臓全体)を染色するには、軟組織を2 mLのエオシンY染色溶液に入れ、サンプルを24時間インキュベートします。インキュベーションプロセス中にサンプルを水平に振とうするプレート(約60 rpm)に保ちます。
   手記：エオシンY染色溶液は、蒸留水中で30%(w / v)の濃度を持っています。サンプルが染色液で完全に覆われ、サンプルがサンプル容器内を自由に移動できるように、染色液の容量を選択してください。インキュベーション時間は他のサンプルでは異なる場合があり、それに応じて調整する必要があります。
3. 染色後、軟部組織サンプルをサンプル容器から慎重に取り出します。
   1. 余分な汚れをセルロースティッシュペーパーで丁寧に取り除きます。
   2. 軟組織サンプルをエタノール気相の上の円錐形のサンプル容器に入れて保存し、さらに使用します
      手記：円錐形のサンプル容器には、軟部組織サンプルを湿らせ、アーチファクトを防ぐために、チューブの底に常に数滴の70%(v / v)エタノールが含まれている必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Falconの50ml遠心分離管	VWRの	〒734-0453
ホルムアルデヒド溶液、37%	カール・ロス	CP10.2	酸フリー、~10% MeOHで安定化
氷酢酸	アルファ・アエサル	36289.AP通信
エオシンY二ナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	E4382	バイオロジカルステインコミッションによる認定
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	メルク	L1825	ダルベッコの公式、カルシウムとマグネシウムなし
Nalgene のサンプルチューブ	カール・ロス	ATK5.1
ロッキングシェーカーST5	猫	〒60281-0000
セルロースティッシュペーパー	VWRの	〒115-0600
エッペンドルフの微量遠心チューブ	VWRの	〒211-2120	セーフロック、2.0 ml
エタノール絶対 ベイカー分析	VWRの	80252500
ステリンのペトリ皿
鉗子、USBECK Laborgeräte著	VWRの	〒232-0096
プラスチックパスツールピペット	カール・ロス	EA68.1	目盛り付き、1 ml