パラフィン包埋組織切片のH&E染色:ヘマトキシリンとエオシン色素の組み合わせを用いた肝臓組織切片の可視化のための鑑別染色技術

Abstract

出典:Ellis, J. L et al., ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的分析. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、パラフィン包埋組織切片の組織学を研究するためのヘマトキシリンとエオシン染色の技術について説明します。この手順には、組織の脱パラフィン化とそれに続く組織内の細胞の染色が含まれます。染色すると、核ははっきりと青色に見え、細胞質内のタンパク質はピンク色を示します。

Protocol

1. 染色液の調製

1. ハリスヘマトキシリンストック溶液をろ過して、沈殿した固形物を除去します。
2. コーヒーフィルターを半分に折り、フィルターが円錐形になるようにします。サイドパネルを開いて、液体がフィルターを通るようにし、破片を捕らえることができます。
3. フィルターを漏斗の中に入れ、漏斗をガラス製のメディアボトルに入れます。ストックヘマトキシリンをフィルターに徐々に注ぎます.
   注意：ヘマトキシリンは、目に入ったり、摂取したり、吸入したりすると危険です。.常に白衣と手袋を着用し、原液はケミカルフードで取り扱ってください。
4. 125 μL の 12 N HCl を 250 mL の ddH₂O に添加して、0.05% HCl を調製します。
5. ガラス瓶に1%エオシンY(水溶液)25 mL、1%フロキシンB(水溶液)2.5 mL、95%エタノール195 mL、氷酢酸1 mLを混ぜ合わせて、エオシンY-フロキシンB溶液混合物を調製します。渦巻かせてよく混ぜ、RT
   で保存します 注意：エオシンYは、目に入ったり、摂取したり、吸入したりすると危険です。常に白衣と手袋を着用し、原液はケミカルフードで取り扱ってください。
6. 2mLの卵水に2mLの純エチルアルコールを加えて98%エタノールを調製します
   注意：エチルアルコールは目を刺激する物質です。エチルアルコールを取り扱うときは、常に適切な保護具を着用してください。また、可燃性であるため、それに応じて取り扱いおよび保管する必要があります。
   注:急性エタノール処理を行う前に、毎回新鮮な2%エタノールを準備してください。

2. パラフィン切片のヘマトキシリンとエオシン染色

1. スライドを100%キシレンに15分間浸して脱パラフィンし、さらに15分間新鮮な100%キシレンに交換します。
2. 液体がスライドからきれいに流れ落ちるまで、スライドを次の一連の段階的なエタノールに浸して、スライドを再水和します。各溶液について、8〜10回、100%エタノール、95%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、50%エタノール、30%エタノール、および脱イオン水
   手記：プロトコールはここで停止でき、スライドはRTで水中に数時間放置できます。必要に応じて、スライドを水O/Nに4°Cで保存することができます。
3. スライドを100%ろ過したハリスヘマトキシリンに4分間入れ、すぐに脱イオン水を入れた容器に戻します。脱イオン水を、セクションから最も遠いコンテナの後ろの隅に流します。水が紫色でなくなるまで、定期的に容器を空にします。
   手記：セクションがスライドから外れる可能性があるため、水がスライドに直接流れ込まないようにしてください。
4. グースネックライトを使用して、解剖顕微鏡でヘマトキシリン強度をすばやく確認します。スライドを乾燥させないでください。汚れが希望の強度に達した場合は、次の手順に進みます。色が十分に暗くない場合は、スライドを100%ヘマトキシリンに1分間入れ、水洗いを繰り返してから再度確認します
   手記：ヘマトキシリンは、エオシン染色中に色が失われないように、十分に暗くする必要があります。しかし、細胞質にヘマトキシリン染色が見られる場合は、切片が過剰に染色されています。
5. スライドを0.05% HClに2回浸し、すぐにきれいな脱イオン水で容器に戻します。水を空にし、容器に水を2回補充します。
6. スライドを95%エタノールに30秒間移し、次に95%エタノールを入れた新しい容器に30秒間移します。
7. スライドをエオシンY-フロキシンB溶液に2分間入れ、スライドを前の95%エタノール容器に戻し、解剖顕微鏡で色の濃さをすばやく確認します。染色が十分であれば、次のステップに進みます。そうでない場合は、エオシン溶液に30秒間戻り、再度確認し、必要に応じて繰り返します。
   手記：十分なエオシン染色は明るいピンク色で、ヘマトキシリン染色とは明らかに対照的です。顕微鏡で確認する際は、偽色が観察されないように、スライドの裏側から溶液を必ず拭き取ってください。エオシンは95%のエタノールで構成されているため、色の濃さを確認しながら95%エタノールに長時間浸出する可能性があります。
8. スライドを100%イソプロパノールに15秒間移し、新しい100%イソプロパノールと交換し、スライドをさらに15秒間イソプロパノールに戻します。このプロセスを合計6回のイソプロパノール洗浄で繰り返します
   注意：イソプロパノールは目と呼吸器の刺激物です。常に適切な保護具を着用し、飛沫を避けてください。また、引火性が高いため、それに応じて保管および取り扱う必要があります。
   手記： 試薬を節約するには、最初の(最もピンク色の)イソプロパノール洗浄のみを廃棄してください。他の5つの洗浄液は、1から5までの番号が付けられたボトルに保管し、次の染色に再利用します。ウォッシュを再利用する場合は、「1」の番号が付けられたボトルから始めて、使用後は廃棄してください。ウォッシュ「2」を使用したら、「1」のボトルに注ぎます。最終的な洗浄は常に新鮮なイソプロパノールでなければなりません。
9. スライドを100%キシレンに3分間入れ、一度に1枚のスライドを取り外し、カバーガラスを置きます。
   1. 切片を覆うのに十分な封入剤を追加し、100%キシレンに浸します.
      手記：このステップにより、封入剤の表面が滑らかになり、気泡が除去されます。
   2. スライドの底にカバースリップを貼ります.
      手記：封入剤はスライドを所定の位置に引っ張る必要があります。カバーガラスがまっすぐでないか、完全に固定されていない場合は、軽くたたいて所定の位置に固定します。
   3. 余分な封入剤をペーパータオルで拭き取り、細い線だけが見えるようにします。ティッシュワイプをキシレンに浸し、スライドの裏側を拭いて、滴り落ちた媒体を取り除きます。スライドを段ボールのように頑丈で可動性のある表面に平らに置きます。残りのスライドをすべて同じ方法でカバースリップします。キシレンをボンネット内で10分間蒸発させます.
      手記：キシレンで汚染された材料は、蒸気が逃げるのを防ぐために、フード内の密閉容器に取り除いて廃棄する必要があります。
10. 封入剤をRT O/Nで硬化させます。

3. 染色スライドのイメージングと保存

1. 複合倒立顕微鏡の画像セクション.
   手記：スライドは無期限に室温で保管できます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
95%エタノール(EtOH)	株式会社デコンラボ	2801	可燃 性
チャージドスライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550*16
解剖顕微鏡	ライカバイオシステムズ	ライカ Mz 95
エオシン-フロキシンステインセット	ニューカマーサプライ	1082Aの
エチルアルコール	シグマ・アルドリッチ	E7023	可燃 性
ハリスヘマトキシリン	ポリサイエンティフィックR&Dコーポレーション	S212	刺激
塩酸(HCl)	フィッシャーサイエンティフィック	A144(エー144	刺激
イソプロパノール	ニューカマーサプライ	12094E	可燃 性
キシレン	フィッシャーサイエンティフィック	X3S-4	刺激