In vitroでの転移性コロニー形成を評価するためのメチレンブルー染色:がんマウスモデルから採取したがん細胞を定量化することにより転移を評価するための染色手順

要約

出典:Nagai-Singer, M. A., et al.4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善するためのコンピュータベースの画像解析の使用。J. Vis. Exp.(2020年)

この動画では、マウスモデルの遠隔臓器から採取したがん細胞を注入後に培養して得られる染色コロニーをカウントし、転移負荷を定量化するメチレンブルー染色の手順について説明します。

プロトコル

すべての動物モデル手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ティッシュの処理

>注:このセクションのすべての手順は、滅菌技術を使用して実行する必要があります。

1. マウス1匹につき15 mLコニカルチューブ1本を標識し、各チューブに2.5 mLのIV型コラゲナーゼ混合物と30ユニットのエラスターゼを加えます。IV型コラゲナーゼ混合物を作製するには、1x HBSSおよび滅菌フィルター1 mLあたり2 mgのIV型コラゲナーゼを溶解します。これは、-20°Cで最大12か月間保存でき、必要に応じて解凍できます。
2. 採取したマウスの肺を2番目の、そのサンプルの1x HBSSウェルに移します。鉗子を使用して渦巻き状に回転させ、残っている血液を取り除きます。清潔な肺を空の3.5cm組織培養プレートに移します。ハサミで肺をミンチにします。2.5 mLの1x HBSSでプレートをすすぎ、1x HBSSと肺片を、コラゲナーゼ/エラスターゼカクテル(合計5 mL)がすでに含まれている15 mLの円錐形チューブに移します。.
3. 4°Cで75分間インキュベートし、この間もサンプルの混合を続け、チューブをロッカーまたは回転ホイールに置きます。このインキュベーションステップでは、各マウスの50 mL遠心チューブと10 cm組織培養プレートを標識します。希釈を行う場合は、希釈のために十分な10cm組織培養プレートにラベルを付けます.
   手記： 組織培養プレートの蓋にラベルを付けます。プレート自体にラベルを付けると、書き込みがFiji-ImageJの分析に干渉します。
4. 各チューブの容量を1x HBSSで合計10 mLまで上げます。70 μmのセルストレーナーに内容物を50 mLのコニカルチューブに注ぎます。1 mLシリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーでサンプルを穏やかに粉砕し、より多くの細胞がろ過できるようにします。
5. 室温(RT)で350 x gで5分間遠心分離します。上清を捨て、1x HBSS10 mLでペレットを洗浄します。この手順を 2 回繰り返します。
6. ペレットを10 mLの60 μM 6TG完全培地(RPMIまたはIMDM)に再懸濁します。10 cmの細胞培養プレートでサンプルをプレート化し、必要に応じて希釈スキームを使用します。37 °C、5% CO₂ で 5 日間インキュベートします.
   注:1:2、1:10、および1:100は、研究パラメータに基づいて経験的に決定する必要がある一般的な希釈です。
   注意:6TGは有毒です。取り扱いには注意を払い、廃棄に関するすべての環境衛生および安全ガイドラインに従ってください。

2. プレートの染色

1. 培養培地を皿から適切な廃棄物容器に注ぎます。プレートあたり5 mLの原液メタノールを加えて細胞を固定し、RTで5分間インキュベートし、メタノールがプレート全体を覆うように渦巻くようにします
   注意：メタノールは、摂取、吸入、または皮膚に付着すると危険です。このステップにはドラフトを使用します。
2. プレートからメタノールを適切な廃棄物容器に注ぎます。プレートあたり5mLの蒸留水でプレートをすすぎ、適切な廃棄物容器に水を注ぎます。プレートあたり5 mLの0.03%メチレンブルーを加え、RTで5分間インキュベートし、メチレンブルー溶液がプレート全体を覆うように渦巻
くようにします。
3. メチレンブルーを適切な廃棄物容器に注ぎます。プレートあたり5mLの蒸留水でプレートを再度すすいでください。プレートを逆さまにし、ペーパータオルで拭き取り、余分な液体を取り除きます。プレートを蓋に置き、RT.
   で一晩風乾させます 手記： 転移性コロニーは青色になります。プレートが乾燥すると、RTで無期限に保存できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A412SK-4 (英語
メチレンブルー	シグマ・アルドリッチ	03978-250ミリリットル
RMPI-1640 ミディア	ATCCの	2001年30月
ロッカーまたは回転ホイール	任意	任意
PESメンブレン付き滅菌使い捨てフィルター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒568-0010
IV型コラゲナーゼ	シグマ・アルドリッチ	C5138
3.5 cm組織培養プレート	ナンクローン	153066
10 cm組織培養プレート	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-22
15 mL遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-70C
1X ハンク平衡生理食塩水 (HBSS)	サーモサイエンティフィック	SH3026802
50 mL遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-49A
70 μM セルストレーナー	フィッシャーサイエンティフィック	22-363-548
70%エタノール	シグマ・アルドリッチ	E7023	脱イオン水で70%に希釈します
孵卵器			5% CO2 および 37 °C の能力が必要です
鉗子	ロボズ	RS-8100
遠心機	任意	任意	125 x gおよび300 x g
蒸留水	任意	任意
エラスターゼ	MPバイオメディカル	100617

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