細胞の過ヨウ素酸シッフ染色:末梢血単核細胞のグリコーゲンレベルを検出するためのIn Vitro技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 全血からのPBMC分離

>注:この手順は、滅菌技術と製造業者滅菌装置を使用してバイオセーフティキャビネットで実施してください。

1. ヘパリン処理された(抗凝固剤)採血チューブから10〜15mlの全血を50mlの滅菌円錐管に慎重に注ぎます。軽度の血液のこぼれの場合は、クリーニングティッシュを使用して_ddH2Oおよび70%EtOHで拭いてください。
2. 円錐管内の血液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS 1x)pH 7.4で1:1の比率に希釈します。最大総容量が30mlを超えないようにしてください。
3. セロジカルピペットガンを使用して、気泡を避けて穏やかに混合します.
   手記：キャップ内の血液の蓄積とその後の遠心分離中の浸透を避けるために、チューブを反転させて混合しないでください。
4. 13 mLのFicoll-paque(材料表を参照)を新しい容量50 mlの円錐チューブに加えます。チューブをラックに直立させておきます。
5. トランスファーピペットを使用して、希釈した血液を採取し、トランスファーピペットの先端を上部近くのチューブの内壁に接触させます。ゆっくりと安定した圧力で、チューブの内壁に沿って血液を移し、ショ糖層の上に血液層を形成します。すべての血液が移るまで、この手順を数回行います。
6. チューブにしっかりとキャップをし、中加速を5に、減速をゼロに設定したスイングローターで、室温で700 x gで30分間チューブを遠心分離します。
7. チューブをゆっくりと取り出し、層を乱さずにバイオセーフティキャビネットに戻します。
8. PBMCが配置されているバフィーコート(薄い曇った白い層)を、PBS /プラズマ層とフィコール層の間に置いたトランスファーピペットで慎重に収集します。ショ糖層の収集を避け、赤血球層を乱さないでください。
9. バフィーコートを新しい50mlの滅菌円錐管に移します。すべてのPBMCを収集するには、手順1.8を数回繰り返す必要がある場合があります。
10. PBMCでチューブにPBS pH 7.4を加え、45 mLのマークまで充填します。チューブをよく振ってください。渦巻きにしないでください。
11. 洗浄1:最大加速と最大減速の両方を9に設定して、480 x gで15分間遠心分離します。円錐管の底部にPBMCのペレットが形成されるのを観察します。
12. PBS(上清)を漂白剤10mlの入ったプラスチックビーカーに捨てます。
13. 起伏のある表面(つまり、空のラック)に対して穏やかに「ラッキング」して、細胞ペレットを緩めます。渦巻きにしないでください。
14. 25 mlの新鮮なPBS pH 7.4をチューブに加えます。複数のチューブを処理する場合は、このステップでペレットを一緒にプールします。
15. 洗浄2:最大加速と最大減速の両方を9に設定して、チューブを480 x gで12分間遠心分離します。
16. PBS(上清)を漂白剤のスプラッシュでプラスチックビーカーに捨てます。
17. 起伏のある表面(つまり、空のラック)に対してそっと「ラック」します。渦巻きにしないでください。
18. チューブに25mlの新鮮なPBSを加えます。
    1. 50 μlの細胞を取り出し、生存率をカウントするために微量遠心チューブに移します。
    2. 等量 (50 μl) のトリパンブルー (生存率染色剤) を加え、ピペットで上下させて穏やかに混合します。
19. 10μlを取り出して血球計算盤に移し、mlあたりの細胞数の生存率を確認します。
20. 必要な量の細胞を取り出し、最大加速と最大減速の両方を9に設定して、チューブを480 x gで12分間遠心分離します。
21. PBS(上清)を漂白剤と一緒にビーカーに捨てます。
22. 起伏のある表面(つまり、空のラック)に対してそっと「ラック」します。80 μlのPBSをチューブに加えます。

2. PBMCスライドの作成

1. 80 μlの細胞を顕微鏡スライドに置きます。別のスライドを使用してドロップを塗りつけるか、スライドの両端にそれぞれ40μlの2滴を置きます。
2. スライドを生物学的安全キャビネットに入れて乾燥させます。つや消し面に鉛筆でスライドにラベルを付けます。

3. スライド上のサンプルの固定

1. 0.5 mlの37%ホルムアルデヒドを4.5 mlの99%エタノールに混合して固定液を調製します。
2. スライドが乾燥したら、作りたての固定液2mlを取り出し、スライドの全面を覆うようにスライドに注ぎます。
3. 溶液をスライド上に1分間放置し、水道水で1分間すすぎ、自然乾燥させます。

4. ネガティブコントロールのためのアミラーゼ溶液を作る

1. 0.25 gのアミラーゼ粉末を取り、50 mlの蒸留水に溶解します。きれいな100mlのビーカーに溶液を注ぎます。
2. スライドをビーカーに浸して、スライドの半分が処理を受け、残りの半分が未処理のままになるようにしてから、室温で15分間インキュベートします(図1C)。
3. スライドのどちら側がアミラーゼ治療を受けているかをメモします。スライドの裏側に、治療とコントロールの境界を示す線を引きます。
4. スライドをddH₂Oで洗浄してアミラーゼ溶液を取り除き、スライドを自然乾燥させます。

5. 過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色とイメージングを行う

>注:PAS試薬は吸入すると毒性があり、腐食性があるため、手順は化学ドラフト内で行う必要があり、廃棄物は施設のガイドラインに従って適切に処分する必要があります。

1. スライドを平らな面に置き、サンプルに1.50〜2.00mlの過ヨウ素酸溶液を注ぎます。室温で5分間インキュベートします。
2. スライドを蒸留水で数回すすぎます。
3. スライド上に1.50〜2.00mlのシフ試薬を注ぎ、室温で15分間インキュベートします。
4. スライドを蒸留水で5分間洗い、自然乾燥させます。
5. スライドに10 μlの封入剤を塗布し、2枚の小さなカバースリップで覆うか、または50 μlを塗布して1枚の大きなカバースリップを使用します。
6. カバースリップの端に透明なマニキュアを塗り、一晩乾かします。

6. 100倍対物レンズを使用して双眼光学顕微鏡で画像を取得する

図1:PBMCでのPAS染色の段階的な方法論。(A)まず、PBMCの単離はフィコールグラジエントによって達成され、左のパネルは遠心分離前の調製物を示し、右のパネルは遠心分離後のPBMCを含むバフィーコートがチューブの中央に観察されるところを示しています。 スライドは、プラスチックの洗浄ボトルから蒸留水でやさしくすすぎます。 (C)次に、スライドをアミラーゼ溶液で半分満たされた100mlビーカーに入れ、グリコーゲンを溶解します。スライドはやさしくすすぎます。 (D)スライドを過ヨウ素酸溶液で処理し、糖類の酸化が起こります。スライドはやさしくすすぎます。これにより、余分な過ヨウ素酸が除去され、酸化ステップが停止します。 (E) シッフ試薬をスライドに加えると、酸化ステップ中に生成されたアルデヒドと反応します。この無色の試薬は、深紅のマゼンタ製品になります。スライドを穏やかにすすいで、余分なシッフ試薬を取り除きます。