Crystal Violet Staining:コロニー形成アッセイを用いた薬剤耐性がん細胞の可視化技術

要約

出典:Mohr, L. et al., Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-Mytotic Agent Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、化学療法薬の薬剤耐性がん細胞に対するクリスタルバイオレット染色手順を使用した細胞生存率アッセイを実演します。

プロトコル

1. コロニー形成アッセイによる獲得ドセタキセル耐性の機能的評価

>注:このプロトコルでは、コロニー形成アッセイを使用して化学療法抵抗性が評価されています。細胞生存率の評価に使用される代替方法(MTSアッセイなど)は、研究者の好みに基づいて使用することができます。

1. ウェルあたり2,000個の細胞(DU145または22Rv1、親細胞耐性とドセタキセル耐性の両方)を6ウェルプレートにプレートし、ウェルあたり2 mLの培地を使用します。
2. 24時間後、ドセタキセルの濃度を増やします(親細胞:0.25、0.5、1、2.5および5 nM;DR細胞:DU145および22Rv1細胞株の両方について、50、125、250、500、および1,000 nM)。DMSOは、ドセタキセルの最高用量に使用したのと同じ量のコントロールとして、1つのウェルにのみ添加します。
3. 72時間後、薬物含有培地を吸引し、新しいドセタキセルフリー培地を追加します。.
4. 顕微鏡でコロニーが見えるまで、プレートを1〜2週間インキュベートします。
5. コロニーを染色するには、2〜3 mLのPBSでやさしく洗浄し、2〜3 mLのクリスタルバイオレット溶液(0.1% w/vの10%ホルマリン)で組織培養フードまたはヒュームフード内で20分間インキュベー
トします。
6. 染色液を取り出し、2〜3mLのH₂Oでプレートを洗浄し、H₂Oを取り除き、プレートを風乾します。
7. ウェルを視覚化し、マーカーペンを使用して手動でコロニーをカウントすることで結果を分析します(同じコロニーを2回カウントすることを避けるため)、細胞生存率のパーセンテージをグラフで表します。図表現のためにプレートのデジタル画像を撮ります(図1)。

結果

図1:ドセタキセル耐性細胞モデルの機能的および表現型の特徴付け。示されたドセタキセル濃度で72時間処理した親細胞およびドセタキセル耐性細胞の代表的なコロニー形成アッセイ。各処理濃度のコロニーの割合は、含まれているグラフで表されます。実験は三重で、データはSD±平均を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DU145細胞	ATCCの	HTB-81
22Rv1セル	ATCCの	CRL-2505
ドセタキセル	セレックケミカルズ	S1148	DMSO(10mM)で
6ウェル組織培養プレート	隼	353046
RPMI 1640 ミディアム	ギブコ	11875093	10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充
ファンデーションBウシ胎児血清	双子座	900208
1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	コーニング	21-040センチ
クリスタルバイオレット	シグマ・アルドリッチ	C0775
10%ホルマリン溶液	シグマ・アルドリッチ	HT501128