蛍光銀染色:ポリアクリルアミドゲル中の総タンパク質を可視化する技術

要約

出典:Wong, A. Y. H. et al.ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質の蛍光銀染色。J. Vis. Exp.(2019年)

この動画では、蛍光プローブを用いて総タンパク質を可視化するためのポリアクリルアミドゲルの銀染色法を実演します。

プロトコル

1. ゲルの調製

1. 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)バッファーを充填したミニゲルタンクを使用して、4% - 12% Bis-Trisタンパク質ゲル(1 mm、15ウェル)でSDS-PAGEを実施します。
2. 蒸留水、ドデシル硫酸リチウム(LDS)緩衝液、およびサンプル還元剤の混合物でサンプルを希釈します。
3. 最初のレーンに2倍のストック量(10μL)をロードし、次に通常のストック量(5μL)とその後のストックの一連の2倍希釈(13希釈、2倍から8192倍)をロードします。
4. ゲルを200Vの定電圧で30分間泳動します。

2. ゲルの固定

1. 電気泳動後、ゲルを40%エタノール/10%酢酸の100 mL溶液にオービタルシェーカーで50 rpm、室温2回(それぞれ30分間)、または4°Cで一晩浸します。
2. ゲルを清潔な容器内の超純水で各3回10分洗浄します。洗浄ステップは重要です。蛍光現像ステップで固定液中の酸が適切に除去されないと、過剰なTPE-4TAが酸によって活性化され、ゲル内に強いバックグラウンド蛍光が発生します。

3. AgNO₃溶液の調製とゲルの銀含浸

1. 含浸用の_AgNO3溶液(0.0001%)を作るには、まず、0.01gのAgNO3を10mLの超純水に溶かして、0.1%のAgNO3原液を調製します。次に、0.1% AgNO₃ ストック溶液 100 μL を 100 mL の超純水に加えて、ワーキング ソリューションを作成します
   手記：AgNO₃溶液は、使用前に暗所で保管する必要があります。
2. 密封されたガラス容器内のオービタルシェーカーで、100 mLの銀作業溶液をゲルに1時間含浸させます。銀の含浸は、アルミホイルで光から保護されたドラフトの下で行うことが重要です。
3. ゲルを超純水(約100mL)で清潔な容器に入れ、2×60秒洗浄します。

4. ゲルの蛍光発生

1. 色素ストック溶液(0.1 mM)を調製するには、50 mLの超純水に3.0 mgのTPE-4TA色素を加えます。溶液を数分間超音波処理し、染料を溶解するためにNaOH溶液(例えば1M)を加えます。
2. 365 nmのUVランプで溶液の蛍光をチェックし、色素分子が完全に溶解していることを確認します。弱い溶液または非発光溶液のみが完全溶解を示します.
   手記：染料TPE-4TAは、Xieらによって最近報告されたプロトコルに従って合成されました。TPE-4TA溶液は非常に安定しており、数ヶ月間暗闇に置いておくことができます。
3. 蛍光現像液100mL(10μM)を調製するには、超純水90mLにTPE-4TA原液10mLを加えます。pHメーターで溶液のpHを確認し、水酸化ナトリウム溶液(1μM)で7〜9に調整します。
4. ゲルを、100 mLの蛍光現像液を入れた清潔で密封可能な容器に移します。ゲルが溶液に完全に浸されていることを確認してください。容器を密封します。光から覆い、室温で50rpmのオービタルシェーカーで一晩振とうします。あるいは、AIE現像液を80°Cに予熱して染色し、室温で放置することで、インキュベーションステップを約~2時間に短縮することもできます。

5. 脱染とイメージング

1. ゲルを清潔な容器に移し、10%エタノール100mLで30分間染色します
   手記：水だけでゲルを洗うことができます。ただし、脱染には10%エタノール溶液を使用する方が時間効率が高くなります。これにより、脱染プロセスを数時間から30分に短縮できます。
2. ゲルを超純水で5分間すすぎます。
3. ゲルドキュメンテーションマシンにより、365 nmチャネルまたは302 nmチャネルでゲルをイメージングします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
LDSサンプルバッファー(4X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0007	試薬
4-12% Bis-Tris タンパク質ゲル、1.0 mm、15 ウェル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0323BOX	プレキャストゲル
サンプル還元剤 (10X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0004	試薬
MES SDSランニングバッファ(20倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0002	試薬
ミニジェルタンク	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A25977 (英語)	備品
300 W 電源(230 VAC)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PS0301	備品
未染色タンパク質ラダー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26614	見本
硝酸銀	シグマ・アルドリッチ	31630-25G-R	試薬
エタノール	ブラッグと共同	42520J	試薬
酢酸	J.T.ベイカー	103201Aの	試薬
ミリQシンセシスA10	メルク	-	18.2MΩ.cmの水を提供
ゲルドキュメンテーションシステム(c600モデル)	Azure バイオシステム	-	備品