ショウジョウバエ幼虫の油滴染色:BODIPYベース色素を用いた正常条件およびストレス条件下での脂肪滴蓄積評価法

要約

出典:Wei, C., et al., Drosophila LarvaeにおけるOenocytesの解剖と脂質液滴染色. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、親油性蛍光BODIPYベースの色素を使用して、ショウジョウバエの幼虫の好奇心細胞(肝細胞様細胞)の脂肪滴染色を示しています。これらの細胞は、発生中や飢餓などの環境ストレスに応答した脂質代謝を研究するためのモデルとして機能します。

プロトコル

1. 幼虫の飢餓治療

>注:3番目の幼虫では、通常の摂食条件下では、エノサイトに検出可能な脂質滴がほとんどまたはまったくありませんが、飢餓などのストレス条件下では、多数の大きな脂肪滴がエノサイトに誘導される可能性があります。この方法をさらに検証するためには、これらの幼虫を前処理して、エノサイトに脂質滴生合成を誘導する必要があります。ここでは、12時間、24時間、36時間の飢餓時間コースがパラダイムとして選択されました。特に、短期間の飢餓(例えば、3時間)は、エノサイトに検出可能な脂肪滴を誘導するのに十分です。飢餓の期間は、特定の実験目標と設定によって異なる場合があります。

1. 飢餓のための部屋を作り、治療を制御します。
   1. 飢餓治療室の場合:適切なサイズの濾紙を6cmのペトリ皿に入れ、濾紙にPBS1mLをピペットで移します。
   2. コントロール治療チャンバーの場合:ブルーミントン標準コーンミール食品5mLをペトリ皿に入れます。.
2. へらを使って、まだ食品に潜っている幼虫を含む食品の最上層をそっと掘り起こし、5mLのPBSで満たされたペトリ皿に移します。PBSで幼虫をそっとかき混ぜて、幼虫から食品の汚染を取り除き、できるだけきれいにします。
3. 小さな絵筆を使用して、ほぼ同じサイズの40匹の3番目の幼虫を収集します。それらをランダムに飢餓室または制御室に分類し、それぞれ20匹の幼虫を配置します。
4. チャンバーをインキュベーターに25°C、湿度60%で置き、12時間、24時間、および36時間の治療を行います
   注:飢餓室の幼虫には、幼虫の脱水を避けるために、12時間ごとに1mLのPBSを追加してください。

2. 好奇心細胞の解剖

1. 小さな絵筆を使用して、適切な年齢(治療後12時間、24時間、または36時間)の幼虫を選び、5 mLの氷冷PBSで満たされた新しいペトリ皿に移して洗浄します
   注:コントロールチャンバーで幼虫を扱う場合は、手順2.2を繰り返して、食品の汚染を除去します。
2. 解剖プレートに氷冷PBSを充填し、鉗子を使用して幼虫を解剖プレートに優しく移します。次の解剖ステップのために、解剖プレートを実体顕微鏡の下に置きます.
   注:氷のように冷たい温度は、幼虫の動きを遅くし、解剖を容易にするのに役立ちます。
3. 幼虫の腹側を上にし、背側を下にして、鉗子を使用して静かに固定します。前端の咽頭に解剖ピンを通し、後端の気門に別のピンを配置して、幼虫を解剖プレートに固定します><。 注:背側は、気管の背側幹の存在によって最も簡単に識別されます。
4. バンナスのスプリングハサミを使用して、表皮の前端から後端まで(縦方向に)切開します。
5. 鉗子を使用して表皮の内部組織を切除します.
   注:気管枝を切除するときは、表皮の内面に局在する好奇心細胞への損傷を避けるために注意が必要です。
6. 鉗子を使用して、解剖ピンを取り出し、表皮をPBSを氷上に充填した1.5mLの微量遠心チューブに移します。
7. 上記の手順に従って、他の幼虫の解剖を続けます。

3. 脂肪滴の染色

1. 解剖した表皮を固定緩衝液中で室温(RT)で30分間ローテーター上でインキュベートします
   手記：固定バッファーには、PBSに4%パラホルムアルデヒド(PFA)が含まれています。
2. 固定バッファーを取り外し、すばやく洗浄します。迅速な洗浄を行うには、PFAの除去後にRTで1 mLのPBSをチューブに加え、組織を穏やかに再懸濁して、PBSを廃棄します
   注意：固定緩衝液には、人の健康に有害なPFAが含まれています。固定バッファーは有害廃棄物として適切に廃棄することが重要です。
3. サンプルをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、考えられるすべてのPFA残留物を洗い流します。
4. 表皮をBODIPY 493/503(1 μg/mL;材料表参照)でローテーター上の室温で30分間インキュベートします
   手記：このステップ以降は、微量遠心チューブをアルミホイルで包んでサンプルを光から保護し、光退色の可能性を最小限に抑えます。
5. BODIPY 493/503染色液を取り出し、サンプルをPBSでそれぞれ10分間3回洗浄して、残留染料を完全に除去します。

4. 実装とイメージング

1. 6 μLの封入剤を清潔な顕微鏡スライドに置きます.
   手記：封入剤は、その退色防止特性に基づいて検出時間を長くするために使用されます。
2. 鉗子を使用して1つの表皮を拾い上げ、ワイプで残りのPBSをそっと取り除きます。
3. 封入剤に表皮を入れ、エノサイトを含む内面が底面、外面が上になるように向きを調整します。
4. カバースリップを表皮にそっと置きます.
   手記：必要に応じて、カバースリップの下から漏れている余分な封入媒体をワイプで取り除きます。イメージングを容易にするために、鉗子でカバーガラスをそっと押し下げ、顕微鏡でスライドを観察するときに、エノサイトクラスターを1つの平面で簡単にイメージングできるようにします。あるいは、組織を取り付けるときに表皮全体が巻き上げられるのを避けるために、表皮を中央の線を介して2つの半表皮に切断することが実用的です。
5. カバーガラスの端に透明なマニキュアを塗って密封します。
6. スライドを遮光サンプルボックスに入れ、マニキュアをRTで乾かします(これには5〜10分かかる場合があります)。
7. 顕微鏡分析を進めます。共焦点顕微鏡(最適化されたGFPまたはFITCフィルター設定で倍率63倍、励起= 488 nm、発光= 503 nm)を使用して画像を撮影し、バックグラウンドを最小限に抑えてクリーンで高感度なシグナルを取得します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
50 mL遠心チューブ	コーニング	430829	50ミリリットル
6cmシャーレ	サーモフィッシャー	150326	6センチ
寒天			フライフード用
アルミホイル	該当なし	該当なし	スメープルを光から守る
ボディピー493/503	インビトゲン	D3922	液滴染色色素
共焦点顕微鏡	ライカ	ライカTSC SP5	共焦点イメージング
コーンシロップ			フライフード用
コーンミール			フライフード用
カバースリップ	シトグラス	10212424C	20 × 20 mm、厚さ0.13-0.17
解剖ピン	該当なし	該当なし
解剖プレート	該当なし	該当なし
濾紙	該当なし	該当なし	直径: 11 cm
固定バッファ	該当なし	該当なし	4% パラホルムアルデヒド (PFA) 含有 1x PBSの
鉗子	デュモン	11252から30	#5
孵卵器	江南	SPX-380	ハエの養殖に
マイクロ遠心チューブ	アクシゲン	MCT-150-Cシリーズ	1.5ミリリットル
顕微鏡スライド	シトグラス	10127105P-G
封入剤	VECTAシールドテープマウント 中程度	H-1000	退色防止封入剤
ネールポリッシュ	パンエラ	AAPR419	カバースリップを密封します
絵筆	該当なし	該当なし
PBSの	該当なし	該当なし	1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl、10 mM Na_{2} HPO_{4}、1.8 mM KH_{2} PO_{4}、pH 7.4)
回転子	Kylin-Bell ラボ機器	WH-986
はさみ	スマートデータメディカル	SR81	バンナススプリングシザー
大豆粉			フライフード用
スパーテル	該当なし	該当なし
標準的なコーンミール食品	該当なし	該当なし	ブルーミントン標準 に準拠 コーンミールフードレシピ
実体顕微鏡	ライカ	ライカ S6E	組織解剖用
紙を拭く	該当なし	該当なし
酵母			フライフード用

の