方法論記事

アミロイド沈着物のhFTAA染色:組織切片の蛍光イメージングのためのオリゴチオフェンベースの色素を用いたアミロイド線維の可視化技術

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Nyström, S. et al., Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、蛍光イメージングに発光結合オリゴチオフェン色素(ヘプタメルホルミルチオフェン酢酸、またはhFTAA)を使用して組織切片のアミロイドを染色する技術について説明しています。アミロイドは、βシートに富む異常なタンパク質の凝集体です。組織サンプル中のそれらの検出は、アミロイド関連疾患またはタンパク病の診断と治療に役立ちます。

プロトコル

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1. LCO染色液

注:hFTAAを商用ベンダーから購入した場合は、セクション1ではなくベンダーの指示に従ってください。

  1. 凍結乾燥したhFTAAを2 mM NaOHに再懸濁して、1 mg/mLのストック溶液を調製します。ストックをガラスバイアルに入れて4°Cに保ちます。在庫は1年間保管できます。
  2. 染色当日は、ストックをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:10,000に希釈して、作業溶液を調製します。

2. 組織サンプルの調製

注:多くの組織タイプは、アミロイドマーカーとしてhFTAAを使用してイメージングできます。例については、図 1 を参照してください。hFTAAは凝集体構造に敏感です。したがって、染色は、エピトープへの曝露がない中断されていない凝集体に対して実施することが望ましいです。組織の固定が最小限に抑えられている場合、最適なスペクトル品質が達成されます。したがって、染色時にエタノールに穏やかに固定された新鮮な凍結材料が好ましい。しかし、例えばホルマリンで固定された組織中のアミロイド沈着物も検出することが可能です。hFTAAは一般的に組織によく浸透します。目的のイメージング技術に適した試料の厚さを選択します。

  1. ホルマリン固定パラフィン包埋切片を使用する場合は、キシレンで一晩脱パラフィンします。切片を99%エタノール、70%エタノール、dH2O、およびPBSの連続浴にそれぞれ10分間浸します。ティッシュ切片を周囲条件下で乾燥させます。注意:キシレンは常に化学ドラフトで取り扱われます。キシレンやその他の有機溶剤は有害です。
    1. 室温で凍結切片を解凍します。組織切片を10%ホルマリンで一晩固定し、99%エタノール、70%エタノール、dH2O、およびPBSの連続浴にそれぞれ10分間浸して再水和します。ティッシュ切片を周囲条件下で乾燥させます。
  2. hFTAAワーキング溶液(約200μL)の液滴を組織切片に加えて覆います。液滴は表面張力によって所定の位置に留まる必要があります。室温で30分間インキュベートして染色します。
  3. ピペットを使用して500 μL PBSで染色液を洗い流し、スライドをPBS浴に10分間浸します。
  4. 蛍光封入剤を使用してマウントします。封入剤が一晩沈殿するのを待ちます.
    注:hFTAA染色は、免疫蛍光、細胞またはオルガネラ特異的マーカーなどの他の染色方法と組み合わせて行うことができます。共染色を行うには、選択した完全な染色プロトコルを実行し、ステップ2.2から始めて、最後にhFTAA染色を追加します。例については、図 2 を参照してください。免疫蛍光法には、640 nm以上で励起される二次抗体を選択することが好ましい。この波長範囲では、hFTAAは吸収しないため、励起できず、蛍光を発しません。これにより、hFTAAと抗体の間にブリードスルーが見られなくなります。

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結果

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図1:(a)肝臓のケラチン凝集体からなるMallory-Denk小体(DAPIで対比染色)、(b)散発性封入体筋炎(s-IBM)筋組織中のp62陽性r封入体、(c)ヒト膵臓のアミロイド体アミロイド、(d)ヒト腸内の免疫グロブリン軽鎖のアミロイド、(e)マウス脳のヒツジスクレイピー(プリオン)、(f)マウス脳の慢性消耗病(プリオン)、(g)APP23マウス脳のAβプラーク、(h)APP / PS1マウス脳のAβ病理、および(i)ヒト患者のトランスサイレチンアミロイドの診断サンプルからの脂肪生検塗抹標本を、標準的なコンゴレッド(CR)スコアリングに従って1〜4に格...

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
hFTAA /エイミートラッカー545 エバ・バイオテック
Dako fluorescene 封入剤アジレントの技術 GM304
ライカDM6000 ライカ
ルーメン 200 事前
Spectraviewシステム ASIスペクトルイメージング
の

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タグ

PBS

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