酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色:TRAP酵素含有培養破骨細胞を検出するためのin vitro技術

要約

出典:Dai, Q., et al.A RANKLベースのマウス骨髄培養アッセイによる破骨細胞形成におけるmTORC1の役割の調査.J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、破骨細胞内のTRAP含有顆粒の存在を検出する酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色技術を実演しています。この技術は、破骨細胞の細胞質にマゼンタ色の色素顆粒沈着物を形成し、倒立顕微鏡で見えるようにします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 準備

1. 破骨細胞特異的な猛禽類欠失マウス(Raptor^fl/fl;Ctsk-cre、以下Rap^Ctsk)をRaptor^のfl/flマウスとCtsk-creマウスを交配させることにより。この研究では、Raptor^{のfl / fl}マウスをWTコントロールとして使用します。
2. 孤立した骨を保持するための氷の入った容器を用意してください。
3. 培地を準備します。
   1. 最小必須培地アルファ(α-MEM)に1xグルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン、および10%ウシ胎児血清を添加して、α-MEM培地を調製します。
   2. 50 mLのα-MEM培地と20 ng / mLのM-CSFからなる骨髄マクロファージ誘導培地を調製します。
   3. 50 mLのα-MEM培地に、M-CSFとRANKLをそれぞれ20 ng/mLで
   調製します。
4. TRAP染色前に以下のバッファーを調製してください。
   1. 6.5 mLのアセトン、2.5 mLのクエン酸塩溶液、および0.8 mLの37%(vol / vol)ホルムアルデヒド溶液からなる固定溶液を調製します。
   2. TRAP染色液を調製します。
      1. 脱イオン水を37°Cに予熱します。
      2. 1.5 mLマイクロチューブに100 μLの高速ガーネットGBCベース溶液と100 μLの亜硝酸ナトリウム溶液を加え、穏やかに反転させて30秒間混合します。
      3. 9 mLの脱イオン水を37°Cに予熱し、ステップ1.4.2.2のジアゾチズファストガーネットGBCベース溶液200 μL、ナフトールAS-BIリン酸溶液100 μL、酢酸溶液400 μL、酒石酸塩溶液200 μL
      を加えます。
      4. TRAP染色混合物溶液を37°Cのウォーターバスに保管します。

2. 解剖 (Day-1)

1. 生後1ヶ月の雌WTマウスとRap^Ctskマウス3匹を_CO2で別々に安楽死させます。訓練を受けた担当者による適切な機器を使用して_CO2吸入を行います。
2. 細菌汚染を防ぐために、6匹のマウスを100mLの75%エタノール(vol / vol)を入れたビーカーに5分間浸し、次に仰臥位で解剖ボードに置きます。脛骨の遠位部を垂直に切開し、眼科用ハサミで後肢に沿って皮膚を解剖します。
3. 股関節の関節靭帯をハサミで切断し、後肢を体幹から脱臼します。
4. 膝関節の関節靭帯を切断し、脛骨と大腿骨を膝関節から慎重に切り離します。はさみで軟部組織をやさしく取り除きます。
5. 1つの遺伝子型のすべての骨を、氷上に2mLのα-MEMを入れた6ウェルプレートの各ウェルに1匹のマウスの1つの骨を入れます.
   手記：細胞の生存率を維持するために、骨をこれらの条件で1時間未満保持する必要があります。

3. 隔離 (Day-1)

1. 6ウェルプレートの1つのウェルに75%エタノール(3 mL)を充填し、他の5つのウェルにα-MEM培地(3 mL)を充填します。
2. 1つの遺伝子型のすべての骨をエタノール洗浄に15秒間入れ、骨をα-MEM培地で10秒間5回洗浄します。
3. ハサミで骨端を切開し、0.45 mmシリンジ針を骨腔に挿入し、α-MEM培地で骨髄を50 mLの遠心チューブに洗い流します。
4. 同じ方法を使用して、骨のもう一方の端から骨腔を洗い流します。少なくとも2回繰り返して、骨が青白くなるまで骨腔を完全に洗います。
5. 骨髄を遠心分離して、800 x g、4°Cで5分間細胞ペレットを得ます。
6. 3 mLの赤血球溶解バッファーを遠心チューブに加え、ピペットで静かに骨髄を再懸濁します。遠心分離管を氷の上に8分間置いて、赤血球を溶解します。
7. 6 mLのα-MEM培地を遠心チューブに加え、細胞溶解を停止します。500 x g、4°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引します。
8. 3 mLのα-MEM培地に再懸濁し、細胞を6ウェルプレート(通常、ウェルごとに1匹のマウス)に入れます。
9. 5% CO₂インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。

4. めっき (0日目)

1. 上清を15 mLの遠心チューブに移し、翌朝、付着していない細胞を回収します。
2. 800 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
3. 4 mLのα-MEM培地に再懸濁します。
4. 20 μLの細胞溶液を取り、20 μLのトリパンブルーと混合します。混合物10 μLを計数チャンバーに加え、溶液1 mLあたりの細胞数を求めます。
5. 適量のα-MEM培地を添加すると、500,000細胞/mLの細胞溶液が得られます。
6. 500 μL と 50 μL の骨髄マクロファージ誘導培地を、それぞれ 24 ウェルプレートと 96 ウェルプレートの各ウェルに添加します。
7. 500 μLおよび50 μLの細胞溶液を、それぞれ24ウェルプレートおよび96ウェルプレートの各ウェルに加えます。
8. 5% CO₂インキュベーターで37°Cで3日間インキュベートします。

5. 微分(3-7日目)

1. めっきの3日後、96ウェルプレートの各ウェルから50μLの培地を回収し、-20°Cで凍結した後、残留培地を吸引します。
2. 1 mL と 100 μL の破骨細胞誘導培地を 24 ウェルプレートと 96 ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ加えます。
3. 37°Cで2日間インキュベートします。
4. 各ウェルから50μLの培地を回収し、残留培地を吸引します。
5. 破骨細胞誘導培地を各ウェルに加えます。
6. 37°Cで1日間インキュベートします.
   手記：この時点で、大きな多核破骨細胞を倒立顕微鏡で観察する必要があります(図1A)。
7. 破骨細胞が見られない場合は、破骨細胞誘導培地を交換し、破骨細胞が見られるまで毎日観察してください。
8. 破骨細胞が形成された後、96ウェルプレートの各ウェルから50 μLの培地を回収します。

6. 酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色

>注:成熟した破骨細胞は、6〜7日間のin vitro培養(ステップ4)後に存在する場合があります。

1. 中程度に吸引し、1x PBSで3回やさしく洗います。
2. 96ウェルプレートの各ウェルの細胞を100 μLの固定溶液で室温で30秒間固定します。
3. 固定後、固定溶液を吸引し、37°Cに予熱した脱イオン水で3回穏やかに洗浄します。
4. 96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのTRAP染色剤を加え、プレートを37°Cのインキュベーターに30分間置き、光から保護します。
5. 染色後、TRAP染色を吸引し、脱イオン水で3回やさしく洗浄してください。
6. 倒立顕微鏡を使用して40倍の倍率で破骨細胞を画像化します。

結果

図1:破骨細胞の代表的な図。(A)6日目に明視野で観察された巨大破骨。赤い線は破骨細胞の境界を描きました。(B)典型的には巨大な多核のTRAP陽性(ワインレッド)破骨細胞。黒矢印は多核破骨細胞の2つの核を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Raptorfl/flマウス	ジャクソン研究所	13188
Ctsk-cre			A gift from S. Kato, 東京大学, 東京, 日本
α-MEM	コーニング	10-022-CVRの
グルタミン	ジビコ	25030081
ペニシリンストレプトマイシン	ジビコ	15140122
ウシ胎児血清	バイオインド	04-001-1A
組換えマウスM-CSFタンパク質	研究開発	Q3U4F9
組換えマウスRANKLタンパク質	研究開発	Q3TWY5
RBC溶解バッファー	ビヨタイム	C3702
トリパンブルー	シグマ・アルドリッチ	302643
アセトン	上海化学工業(株)
クエン酸溶液	シグマ・アルドリッチ	915
ホルムアルデヒド溶液	上海化学工業(株)
酸性ホスファターゼ、白血球(TRAP)キット	シグマ・アルドリッチ	387A-1KT
高速ガーネットGBCベースソリューション	シグマ・アルドリッチ	3872
亜硝酸ナトリウム溶液	シグマ・アルドリッチ	914
ナフトールAS-BIリン酸溶液	シグマ・アルドリッチ	3871
アセテート溶液	シグマ・アルドリッチ	3863
酒石酸塩溶液	シグマ・アルドリッチ	3873
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	コーニング	21-031-CVRの
37% ホルムアルデヒド	西龍科学
IX71	オリンポス
0.45 mm シリンジ
はさみ
蚊の鉗子

マウス の 名 シリーズ 名 名 名 名 名