アリザリンレッド染色:培養骨芽細胞による石灰化を可視化する技術

要約

出典:Kampleitner, C., et al.骨再生のための生体材料に関する生物学的適合性プロファイル。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、Alizarin Red色素を使用して、培養初代骨芽細胞の石灰化またはカルシウム沈着の程度を検出するための染色技術を示しています。

プロトコル

1. Alizarin Red S (ARS) による染色による骨芽細胞 (OB) の石灰化評価

1. 培養プレートの生体適合性足場として使用されるβ-リン酸三カルシウム(β-TCP)ディスクに初代骨芽細胞(OB)を追加します。
2. 無機化培地を添加してから14日後に、一次OBを含むウェルから培地を吸引し、RTで0.5mLの1x PBSで2回すすぎます。PBSを吸引し、10%緩衝ホルマリン溶液0.5mLをRTで10分間添加して細胞を固定します。
3. 10%緩衝ホルマリンをシングルユースピペットで吸引し、0.5 mLの超純水で2回洗浄します。
4. 固定したOBに、超純水に溶解した40 mM ARS染色溶液(pH 4.2)0.25 mLを加え、プレートを室温で10分間、シェーカーで100シェイク/分でインキュベー
トします。
5. シングルユースピペットで染色溶液を吸引し、1 mLの超純水ですすいでください。この手順を5〜10回繰り返して、非特異的な汚れを取り除きます
   手記：すすぎ液は色なしでする必要があります。
6. 超純水を吸引し、冷たいPBS1mLを加えます。プレートを室温で10分間、シェーカーで100シェイク/分でインキュベー
トします。
7. PBSを吸引し、染色されたβ-TCPディスクを新しいウェルに移し、フラットベッドスキャナーでプレートをスキャンして鉱化作用を記録します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
β-リン酸三カルシウムディスク(β-TCP、14 mm)			ディスクは、1150°Cの温度でマッフル炉で焼結されました。生産の詳細な説明は、Zimmer et al(doi:10.1002 / jbm.a.34639)にあります。サンプルをUV照射(片側15分)してから細胞培養に使用しました。
Orthovita Vitoss フォーム (β-TCP/C フォーム)	オルソビタ	2102-1405
アリザリンレッドS	シグマ・アルドリッチ	A5533の
ホルマリン溶液中性緩衝液10%	シグマ・アルドリッチ	HT501128
骨形成性鉱化培地(MM)			α-MEM + 10% 熱不活化 FBS + 1% ペニシリン - ストレプトマイシン + 50 μg/mL アスコルビン酸 + 5 mM β-グリセロリン酸
リン酸緩衝生理食塩水 1x (PBS) pH 7.4	Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010023
超純水:細胞培養水 パイロジェンフリー	VWRの	L0970-500
ウォッシュバッファー			0.05%Tween20を1x PBSに加えます。
24ウェル懸濁培養プレート	グライナーバイオワン	662102
フラットベッドスキャナー:エプソンパーフェクション1200写真	エプソン
シングルユースピペット:血清ピペット	グライナーバイオワン	612301
蒸留水	カール・ロス	3478.4
シングルユースピペット:血清ピペット	グライナーバイオワン	612301