硫酸化グリコサミノグリカンの銀染色:ポリアクリルアミドゲル中の硫酸化グリコサミノグリカンの可視化のための染色法

要約

出典:LaRiviere, W. B., et al. ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色によるグリコサミノグリカンの検出。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、硫酸化グリコサミノグリカンオリゴ糖断片のアルシアンブルーと銀の組み合わせ染色の手順を示しています。この複合染色法は、ポリアクリルアミドゲル中の異なる長さのグリコサミノグリカンポリマーのバンドを大幅に増幅します。

プロトコル

1. 銀染色のプロトコール

1. 銀染色に必要なすべての溶液を事前に準備してください（表1).
   手記：PAGEゲルを染色し、現像し、停止液に入れるまで、PAGEゲルに直接触れないでください。代わりに、清潔なプラスチックまたはガラスのツールを使用してゲルを操作します。ゲルを直接取り扱うと、染色後にゲルに指紋の歪みやその他の目に見えるアーチファクトが生じます。
2. ランが完了したら、脱イオンろ過水で満たされた清潔な中大容器でカセットと抽出ゲルを分解します。
   手記：ゲルを直接扱わないように、ピペットチップなどのプラスチックを使用して、水に浸した状態でゲルをカセットからそっと剥がします。ゲルは壊れやすい場合がありますので、慎重に取り扱ってください。
   1. 水を捨てます。ゲルをアルシアンブルー染色溶液で5分間染色します。
   2. アルシアンブルーステインを捨てます。アルシアンブルー染色液のほとんどが除去されるまで、脱イオンろ過水で2〜3倍すばやくすすぎ/洗浄します。
   3. 脱イオンされ、ろ過された水でロッカーで一晩汚れを落とすことができます。脱イオンおよびろ過された水が十分な量にあることを確認して、残留汚れが一晩でゲルから完全に洗い流されるようにします。
   4. ゲルを50%メタノールで洗浄します(合計40分、溶液を2〜3回交換します)。
   5. 脱イオンろ過水でゲルを30分間洗浄し、水を捨て、さらに3回、合計2時間繰り返し、毎回水を交換します。
   6. 新鮮で清潔な容器に、ゲルを硝酸銀染色溶液で30分間染色します。
   7. 脱イオンしたろ過水で2〜3倍すばやくすすぎ/洗浄し、銀染色液を完全に除去します。
   8. 脱イオンろ過水で30分間洗浄します。水を捨てて、2回、合計90分間繰り返し、毎回ウォーターバスを交換します。
   9. 水を捨て、現像液を追加します。
   10. 現像液を添加したら、ゲルを注意深く観察し、バンドの外観を観察します。染色剤の品質とロードされたサンプルの質量にもよりますが、現像には数秒から数分かかる場合があります。
   11. 目的のバンドが見えたらすぐに現像液を廃棄し、ストップ液で短時間洗浄します。
   12. 停止溶液を廃棄し、洗浄して新しい停止溶液と交換します。ロッカーまたはシェーカーに1時間浸します。
   13. 脱イオンしたろ過水で一晩洗浄します(ただし、溶液洗浄を停止した直後にゲルを画像化できます)。

表1:ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されたグリコサミノグリカンの銀染色に必要な溶液。すべての溶液は、使用前にろ過(0.22μm)する必要があります。

の

>注:すべての溶液は、使用前にろ過(0.22μm)する必要があります。
解決	レシピ	組成	コメント
アルシアンブルー染色液(500mL)	アルシアンブルー8GXパウダー	2.5グラム	所望濃度:0.5%w / v
	2% v/v 氷酢酸	500mL
シルバーステイン(200mL)	脱イオン水	192.7ミリリットル	染色液を新鮮に調製し、1週間以内に使用してください。
	7.6M水酸化ナトリウム	2ミリリットル	作るには、3.04gの水酸化ナトリウムペレットを10mLの水に加えます
	水酸化アンモニウム	3.3ミリリットル
	4M硝酸銀溶液	2ミリリットル	作るには、3.397 gの硝酸銀を5 mLの水に加えます。沈殿を避けるために、攪拌しながら滴下します。
現像液(501mL)	脱イオン水	500ミリリットル	現像液は、24時間以内に新鮮にして使用する必要があります。
	2.5% w/v クエン酸	1 mL	作るには、100mgに4mLの脱イオン水を加えます。クエン酸は新鮮に作らなければなりません。
	ホルムアルデヒド	250μL
停止液(500mL)	脱イオン水	300ミリリットル
	氷酢酸	20ミリリットル
	メタノール	90ミリリットル

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルシアンブルー8GX(ソリッド)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AC400460100
水酸化アンモニウム(液体)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A669S-500	認定ACS
Barnstead GenPure Pro 純水製造システム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10-451-217PKG	任意の水脱イオン/浄化システムは、許容される代替品です
氷酢酸(液体)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A35-500	認定ACS
メタノール(液体)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A412-500	認定ACS
硝酸銀(固体)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S181-25	認定ACS
水酸化ナトリウム(固体)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S392-212
真空フィルターユニット、シングルユース、0.22uM ポアPES、500mL容量	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒569-0020	代替容量とフィルター材料は許容範囲
モレキュラーイメージャー Gel Doc XRシステム	バイオ・ラッド	〒170-8170	同等のゲルイメージングシステムは、許容される代替品です