コロニー形成アッセイのためのギムザ染色:間葉系幹細胞の増殖能を評価するためのin vitro染色手順

要約

出典:Schlaefli, P. et al.凝固した骨髄サンプルから間葉系幹細胞をレスキューする酵素的方法。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、間葉系幹細胞が生存コロニーを形成するための増殖能力を評価するためのギムサ染色手順を実演します。ギムザ染色剤は、主に紺碧色素とエオシン色素で構成された中性染色剤で、細胞成分の電荷に応じて選択的な親和性を持っています。

プロトコル

1. 増殖細胞培養とCFUプレートの播種

1. 細胞(赤血球と単核細胞からなる)を50 mLの基礎培地に再懸濁します:10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U / mlペニシリン、100 mg / mlストレプトマイシン、および2.5 mg / mlアムホテリシンBを補充したAlpha-MEMです。
2. 細胞培養フラスコで細胞を5 x 10°C/cm²の密度でプレート化し、加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。可能な場合は、低酸素(5%酸素)条件を使用してください。CFUアッセイコントロールでは、直径10 cmの細胞培養皿に10⁹の細胞をプレートします。
3. 3日間の培養後、間葉系幹細胞は細胞培養皿に付着し、他の細胞は懸濁したままになります。5 ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加した基礎培地で培地を交換します。CFUアッセイコントロールでは、細胞培養皿も同様に扱います。
4. 週に3回培地を交換しながら、合計2週間細胞培養を続けます。細胞の密度が80%を超える場合は、トリプシン処理により分割します。CFUアッセイコントロールについても、同様に培地を交換しますが、2週間のコースで細胞を分割しないでください。

2. CFUアッセイ用ギムサ染色

1. 皿ごとに10 mlのGiemsa溶液を準備します:ストック溶液(グリセロール:メタノール中の7.6 g / l Gemsa)を滅菌水で1:10希釈します(常に新鮮な作業希釈を準備します)。
2. 細胞培養皿から培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄します。ペトリ皿に液体を塗布するときは細心の注意を払い、細胞を洗い流さないようにしてください。
3. 細胞を純粋なメタノールに室温で5分間固定し、メタノールを廃棄します。Giemsa溶液を加え、加湿インキュベーターで37°Cで60分間インキュベー
トします。
4. PBSで2回洗います。最初にプレートヘッドをペーパータオルで風乾します。コロニーを手動でカウントします。これは、プレートの裏側にあるマーカーペンを使用して実現するのが最適です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
基礎培地コンポーネント
ペンストレップ100X	ギブコ	15140122
ヒトFGF-basic	ペプロテック	100-18B
MEM Alpha w/ヌクレオシド、w/安定型グルタミン	アミメド	1-23S50-I
FBSヒート不活性化	アミメド	2-01F36-I
アムホテリシンB	アプリケム	A1907 (英語
ジェネリック
PBSの	アプリケム	964円91銭
ギムザステイン	アプリケム	A0885
消耗 品
プリマリア細胞培養皿	隼	353803
細胞培養用フラスコ - Flask T300	TPPとは	90301
備品
ストリペット セロロジカルピペット 5ml	コーニング	4487-200EA
加湿インキュベーター Heracells 240	サーモサイエンティフィック	51026331
ヘレウスマルチフュージ1S-R	サーモサイエンティフィック	75004331

) さん