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>注:腸骨稜からの犬の骨髄穿刺物は、犬の飼い主の同意を得て採取されました。イヌ(約10 ml)の骨髄穿刺液は、手術室での離脱直後に15 mlの3.8%クエン酸ナトリウムを添加することにより抗凝固されました。.サンプルは、回収されたのと同じ日に処理するために実験室環境に移されました。
1. ウロキナーゼの調製(1回目の使用前)
- 製造元の指示に従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用してウロキナーゼを再構成します:10mlの注射器を使用して、セプタムインレットフラスコに10mlのPBSを追加します。.乾燥物質を渦巻いて溶解し、1mlあたり50,000注入単位(U)を得る。
- 500 μLのアリコート (各25,000 U) を滅菌チューブに調製します。アリコートは-20°Cで保存し、必要に応じて少なくとも6ヶ月間使用してください。
2. 準備段階(骨髄治療前)
- 凝固した骨髄穿刺液1体につき1アリコートのウロキナーゼ(25,000U)を解凍します(最大25mlの吸引量は、25,000Uの1アリコートを使用して成功裏に治療されています)。
- ウォーターバスまたは振とうインキュベーターを37°Cに予熱します。
3. 血栓の酵素消化物
- すべての作業は層流バイオセーフティキャビネットで行い、処理中の骨髄サンプルの微生物汚染を防ぎます。感染の可能性のある人体材料を扱う場合は、保護手袋の使用と慎重な取り扱いをお勧めします。
- 滅菌済みの50 mLチューブの上に100 μmのセルストレーナーを置きます。骨髄穿刺液を細胞ストレーナーに慎重に注ぎ、ストレーナーを傾けるか、血栓材料の周りを移動します。フィルターメッシュを流れる流れを良くするために、滅菌ピペットチップを使用してください.
手記：血栓の希釈を避ける(例:血栓をPBSで洗浄するなど)。ウロキナーゼは間接的に作用し、効果的な消化のためには生検からの血清の成分(すなわち、プラスミノーゲン)が必要です。血栓材料で手順を続行しながら、濾液はステップ3.6でさらに使用するまでRTに保持できます。
- 骨髄凝固材料を滅菌鉗子を使用して空の細胞培養皿に移します。滅菌メスを使用して、破片を約2mm3の小片に切ります。
- 滅菌鉗子を使用して、血栓の小片を50mlの反応チューブに移します。みじん切りにした血栓が濡れた外観になっていることを確認してください。乾燥しているように見える場合は、手順3.1のろ液の一部を使用して湿らせます。
- 5 mLのマイクロタイターピペットを使用して5回ピペッティングし、血栓を粉砕します。1アリコートのウロキナーゼをサンプルに加えます。37°Cで30分間、水浴または振とうする(穏やかに)インキュベーターでインキュベートします。
- 5 mLピペットを使用して5回ピペッティングして回転させます。この手順は、バイオセーフティキャビネットで実行します。37°Cでさらに30分間インキュベートします。インキュベーション後、5mlピペットを使用して再度5回回転させます。新しい100 μmセルストレーナをパスオーバーして、ステップ3.2の濾液とプールします。
- 細胞懸濁液を周囲温度で500 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てます。以下に説明するように、またはMSC増殖培養のための研究室の標準的な手順に従って、細胞ペレットを培地に再懸濁します。
4. 増殖細胞培養とCFUプレートの播種
- 細胞(赤血球と単核細胞からなる)を50 mLの基礎培地に再懸濁します:10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U / mlペニシリン、100 mg / mlストレプトマイシン、および2.5 mg / mlアムホテリシンBを補充したAlpha-MEMです。
- 細胞培養フラスコで細胞を5 x 107細胞/cm2の密度でプレート化し、加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。可能な場合は、低酸素(5%酸素)条件を使用してください。CFUアッセイコントロールでは、直径10cmの細胞培養皿に10 9個の細胞をプレートします。
- 3日間の培養後、間葉系幹細胞は細胞培養皿に付着し、他の細胞は懸濁したままになります。5 ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加した基礎培地で培地を交換します。CFUアッセイコントロールでは、細胞培養皿も同様に扱います。
- 週に3回培地を交換しながら、合計2週間細胞培養を続けます。細胞の密度が80%を超える場合は、トリプシン処理により分割します。CFUアッセイコントロールについても、同様に培地を交換しますが、2週間のコースで細胞を分割しないでください。
5. MSCの差別化
- 犬のMSCの分化
手記：イヌのMSCは、適切な培地による4週間の刺激により、軟骨原性、骨形成性、および脂肪形成性の系統に分化しました。
- 軟骨原性分化
- 凍結乾燥コラーゲンI型から組成されたスポンジ状の医療機器からキューブ(一辺3mm)を切り出し、細胞を支える足場材料として使用します。
- キューブの上部に 4 x 106 細胞/ml (~70,000 細胞/キューブ) の濃度で MSC を播種します。
- 培地を添加する前に、細胞を立方体に30分間接着させます。
- DMEM/F12 + GlutaMAX、2.5 % FBS、100 units/ml ペニシリン、100 mg/ml ストレプトマイシン、2.5 μg/ml アンホテリシン B、40 ng/ml デキサメタゾン、50 μg/ml アスコルビン酸 2-リン酸、50 μg/ml L-プロリン、1x インスリン-トランスフェリン-セレン X、および 10 ng/ml トランスフォーミング成長因子-β1 からなる軟骨原性培地で MSC-コラーゲンコンストラクトを維持します。
- アルシアンブルー染色を使用して、コンストラクト切片中のプロテオグリカンの蓄積を可視化します。簡単に言うと、0.01% H2SO4 および 0.5M グアニジン塩酸塩に溶解した 0.4% アルシアンブルーで切片 O/N を染色します。次に、切片を40%DMSOおよび0.05M MgCl2で30分間洗浄した。細胞を核速乾赤で対比染色しました。