プロテオグリカンを可視化するためのアルシアンブルー染色:In vitroで間葉系幹細胞分化軟骨細胞培養中のプロテオグリカンを検出する技術

要約

出典:Schlaefli, P. et al., 凝固骨髄サンプルから間葉系幹細胞をレスキューする酵素的方法。

このビデオでは、機能的な軟骨細胞から分泌されるプロテオグリカンを特定するためのアルシアンブルー染色手順について説明しています。この方法は、間葉系幹細胞の成熟軟骨細胞へのin vitro分化の成功を判断するのに役立ちます。

プロトコル

>注:腸骨稜からの犬の骨髄穿刺物は、犬の飼い主の同意を得て採取されました。イヌ(約10 ml)の骨髄穿刺液は、手術室での離脱直後に15 mlの3.8%クエン酸ナトリウムを添加することにより抗凝固されました。.サンプルは、回収されたのと同じ日に処理するために実験室環境に移されました。

1. ウロキナーゼの調製(^1回目の使用前)

1. 製造元の指示に従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用してウロキナーゼを再構成します:10mlの注射器を使用して、セプタムインレットフラスコに10mlのPBSを追加します。.乾燥物質を渦巻いて溶解し、1mlあたり50,000注入単位(U)を得る。
2. 500 μLのアリコート (各25,000 U) を滅菌チューブに調製します。アリコートは-20°Cで保存し、必要に応じて少なくとも6ヶ月間使用してください。

2. 準備段階(骨髄治療前)

1. 凝固した骨髄穿刺液1体につき1アリコートのウロキナーゼ(25,000U)を解凍します(最大25mlの吸引量は、25,000Uの1アリコートを使用して成功裏に治療されています)。
2. ウォーターバスまたは振とうインキュベーターを37°Cに予熱します。

3. 血栓の酵素消化物

1. すべての作業は層流バイオセーフティキャビネットで行い、処理中の骨髄サンプルの微生物汚染を防ぎます。感染の可能性のある人体材料を扱う場合は、保護手袋の使用と慎重な取り扱いをお勧めします。
2. 滅菌済みの50 mLチューブの上に100 μmのセルストレーナーを置きます。骨髄穿刺液を細胞ストレーナーに慎重に注ぎ、ストレーナーを傾けるか、血栓材料の周りを移動します。フィルターメッシュを流れる流れを良くするために、滅菌ピペットチップを使用してください.
   手記：血栓の希釈を避ける(例:血栓をPBSで洗浄するなど)。ウロキナーゼは間接的に作用し、効果的な消化のためには生検からの血清の成分(すなわち、プラスミノーゲン)が必要です。血栓材料で手順を続行しながら、濾液はステップ3.6でさらに使用するまでRTに保持できます。
3. 骨髄凝固材料を滅菌鉗子を使用して空の細胞培養皿に移します。滅菌メスを使用して、破片を約^2mm3の小片に切ります。
4. 滅菌鉗子を使用して、血栓の小片を50mlの反応チューブに移します。みじん切りにした血栓が濡れた外観になっていることを確認してください。乾燥しているように見える場合は、手順3.1のろ液の一部を使用して湿らせます。
5. 5 mLのマイクロタイターピペットを使用して5回ピペッティングし、血栓を粉砕します。1アリコートのウロキナーゼをサンプルに加えます。37°Cで30分間、水浴または振とうする(穏やかに)インキュベーターでインキュベートします。
6. 5 mLピペットを使用して5回ピペッティングして回転させます。この手順は、バイオセーフティキャビネットで実行します。37°Cでさらに30分間インキュベートします。インキュベーション後、5mlピペットを使用して再度5回回転させます。新しい100 μmセルストレーナをパスオーバーして、ステップ3.2の濾液とプールします。
7. 細胞懸濁液を周囲温度で500 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てます。以下に説明するように、またはMSC増殖培養のための研究室の標準的な手順に従って、細胞ペレットを培地に再懸濁します。

4. 増殖細胞培養とCFUプレートの播種

1. 細胞(赤血球と単核細胞からなる)を50 mLの基礎培地に再懸濁します:10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U / mlペニシリン、100 mg / mlストレプトマイシン、および2.5 mg / mlアムホテリシンBを補充したAlpha-MEMです。
2. 細胞培養フラスコで細胞を5 x 10⁷細胞/cm²の密度でプレート化し、加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。可能な場合は、低酸素(5%酸素)条件を使用してください。CFUアッセイコントロールでは、直径10cmの細胞培養皿に^{10 9}個の細胞をプレートします。
3. 3日間の培養後、間葉系幹細胞は細胞培養皿に付着し、他の細胞は懸濁したままになります。5 ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加した基礎培地で培地を交換します。CFUアッセイコントロールでは、細胞培養皿も同様に扱います。
4. 週に3回培地を交換しながら、合計2週間細胞培養を続けます。細胞の密度が80%を超える場合は、トリプシン処理により分割します。CFUアッセイコントロールについても、同様に培地を交換しますが、2週間のコースで細胞を分割しないでください。

5. MSCの差別化

1. 犬のMSCの分化
   手記：イヌのMSCは、適切な培地による4週間の刺激により、軟骨原性、骨形成性、および脂肪形成性の系統に分化しました。
2. 軟骨原性分化
   1. 凍結乾燥コラーゲンI型から組成されたスポンジ状の医療機器からキューブ(一辺3mm)を切り出し、細胞を支える足場材料として使用します。
   2. キューブの上部に 4 x 10⁶ 細胞/ml (~70,000 細胞/キューブ) の濃度で MSC を播種します。
   3. 培地を添加する前に、細胞を立方体に30分間接着させます。
   4. DMEM/F12 + GlutaMAX、2.5 % FBS、100 units/ml ペニシリン、100 mg/ml ストレプトマイシン、2.5 μg/ml アンホテリシン B、40 ng/ml デキサメタゾン、50 μg/ml アスコルビン酸 2-リン酸、50 μg/ml L-プロリン、1x インスリン-トランスフェリン-セレン X、および 10 ng/ml トランスフォーミング成長因子-β1 からなる軟骨原性培地で MSC-コラーゲンコンストラクトを維持します。
   5. アルシアンブルー染色を使用して、コンストラクト切片中のプロテオグリカンの蓄積を可視化します。簡単に言うと、0.01% H₂SO₄ および 0.5M グアニジン塩酸塩に溶解した 0.4% アルシアンブルーで切片 O/N を染色します。次に、切片を40%DMSOおよび0.05M MgCl₂で30分間洗浄した。細胞を核速乾赤で対比染色しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
基礎培地コンポーネント
ペンストレップ100X	ギブコ	15140122
ヒトFGF-basic	ペプロテック	100-18B
MEM Alpha w/ヌクレオシド、w/安定グルタミン	アミメド	1-23S50-I
FBSヒート不活性化	アミメド	2-01F36-I
アムホテリシンB	アプリケム	A1907 (英語
アディポジェニック培地成分
DMEM-ハム F12 + グルタMAX	アミメド	1-26F09-I
軟骨原性培地成分
Biopad - スポンジ形状の医療機器	ユーロリサーチ
L-プロリン	シグマ	P5607
インスリン-トランスフェリン-セレンX	ギブコ	51500056
ヒトトランスフォーミング成長因子-β1	ペプロテック	100-21
アルシアンブルー8GX	シグマ	A3157
核ファストレッド	シグマ	N8002
ジェネリック三ナトリウムクエン酸二水和物	アプリケム	A3901
PBSの	アプリケム	964円91銭
硫酸(H2SO4)	アプリケム	A0655 (日本語)
ジメチルスルホキシド(DMSO)	アプリケム	A1584さん
塩化マグネシウム(MgCl2)	アプリケム	A3618
グアニジン塩酸塩	アプリケム	A1499
消耗 品
50 mL反応チューブ	アクシゲン	SCT-50ML-25-S
10mlシリンジ	ブラウン	4606108V
ステリカン針(22G)	ブラウン	4657624
1.7mlマイクロチューブ	ブルンシュヴィッヒ	MCT-175-C
100 μmセルストレーナー	隼	6.05935
滅菌鉗子	バストスビエガス、SA	〒489-001
滅菌メス	ブラウン	5518059
プリマリア細胞培養皿	隼	353803
Cチップノイバウアー改良型	バイオスイステック	505050
細胞培養用フラスコ - Flask T300	TPPとは	90301
備品
微生物バイオセーフティキャビネット class II	スカン	82011500
ウォーターバス	メメルト	1305.0377
ストリペット セロロジカルピペット 5ml	コーニング	4487-200EA
顕微鏡	オリンポス	CKX41
加湿培養器 Heracells 240	サーモサイエンティフィック	51026331
ヘレウスマルチフュージ1S-R	サーモサイエンティフィック	75004331

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