スーダンIV染色:採取マウス大動脈弓における脂質含みアテローム性動脈硬化性プラークの染色手順

要約

出典:Centa, M., et al.マウスのアテローム性動脈硬化症の定量化。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、採取したマウス大動脈弓の脂肪沈着物を染色するためにスーダンIV染色を使用して、アテローム性動脈硬化症のプラークを視覚化し、アテローム性動脈硬化症の程度を決定する手順を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています

1. 大動脈弓と腕頭動脈の顔面解析

1. 大動脈弓の顔面分析のためのピン留めベッドを準備します。パラフィンワックスフィルムのセグメントを8回折り、25 mm x 25 mmの平らな表面を作ります。黒い電気絶縁テープで包み、大動脈の背景を暗くします。ピン留めベッドの裏側にラベルを貼り、鉛筆でマウス識別番号を書き込みます(通常のペンインクは染色プロセスで消えます)。
2. 大動脈弓をピンベッドに移し、その上にPBSを一滴垂らします。実体顕微鏡下で残りの外膜周囲脂肪組織から大動脈の洗浄を開始します。
   1. バンナスのハサミとデュモン鉗子を使用して、大動脈を操作したり損傷したりすることなく、周囲のすべての脂肪組織を優しく剥がします。スーダンIVは脂肪組織を明るく染色するため、この時点でそのような組織をすべて除去することが重要です
      手記：大動脈を常に湿らせ、必要に応じて追加のPBSを塗布します。
大
3. 動脈内腔にバンナスのはさみを導入して内膜の表面を露出させることにより、冠状面の大動脈を切り開きます。上行アーチの外側の湾曲を遠位方向に切り始め、腕頭動脈を含む枝を切り開いて続けます。下行胸部の背側部分を温存します。
   1. 小さい方の曲率を切り開き、大動脈を折りたたんで開き、内膜の表面を表示します.
      手記： このステップには細かい運動能力が必要であり、習得するにはある程度の練習が必要です。
4. 開いたアーチをピン留めベッドに固定します 細かい昆虫ピンの鈍い端を使用します。マイクロCastroviejoニードルホルダーを使用して、ピンを所定の位置に置きます。ピンを所定の位置に置いたときに、ピンを試料からそっと曲げます。大動脈をベッドに平らに固定し、標本を伸ばさないようにします。ピン留めされたアーチを下向きにして、PBSを充填したシャーレに4°C.
   で保管します 手記： ここでプロトコルを一時停止できます。
5. スーダンIVの作業溶液を準備します。スーダンIV粉末1g、70%エタノール100mL、アセトン100mLを暗いボトルに混ぜ、10分間静かに攪拌します。溶液をろ過する必要はなく、室温で暗く保つと数ヶ月間使用できます。染色色が満足のいくものでない場合は、新しい溶液を作成し、標本を再度染色することができます.
   注意： アセトンは、深刻な眼の炎症を引き起こす可能性のある可燃性の液体です。風通しの良い場所に保管し、取り扱いの際は注意を払ってください。
6. 実験台に5つのシャーレを配置します:1つは70%エタノールで満たされ、1つはスーダンIVワーキングソリューションで満たされ、2つは80%エタノールで満たされ、もう1つはPBSで満たされます。
   1. まず、アーチを下に向けて最初のペトリ皿にピン留めベッドを置き、標本を70%エタノールで5分間すすぎます。標本をスーダンIV作業溶液に移し、アーチを7分間染色します。
   2. 次に、80%エタノールで3分間2回すすぎ、正常な内膜表面を染色します。脱染時間は、結果を最適化するために調整できます。最後に、標本を元のペトリ皿に戻す前に、PBSですすいでください。
7. デジタルカメラに接続された10倍倍率の実体顕微鏡で顕微鏡写真を取得します。小さな金属製の重り(20 mm x 10 mm x 5 mm)を使用して、ピン留めベッドをペトリ皿の底に固定し、PBSに沈められたピン留めアーチの写真を撮ります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
黒色の電気絶縁テープ(幅50mm)	専門小売店		大動脈弓のピン留めベッドを作成するため。
解剖ハサミ(10cm、ストレート)	世界の精密機器	14393	臓器の一般的な解剖用。
デュモン鉗子#5(11 cm、ストレート)	世界の精密機器	500341	大動脈のマイクロダイセクション用。
エタノール 70% (v/v)	VWRケミカルズ	83801.29	引火性の高い液体や蒸気は、風通しの良い場所に保管し、涼しく保ってください。
エタノール絶対≥99.8%	VWRケミカルズ	20821年31	引火性の高い液体や蒸気は、風通しの良い場所に保管し、涼しく保ってください。
ホルムアルデヒド 4% 安定化、緩衝液 (pH 7.0)	VWRケミカルズ	9713.1	吸入、皮膚との接触、飲み込むと有害です。
イソプロパノール	メルク	1096341011	可燃性の液体で、深刻な目の炎症を引き起こし、眠気やめまいを引き起こす可能性があります。.
マイクロカストロビエホニードルホルダー(9 cm、ストレート)	世界の精密機器	503376	大動脈弓のピン留め用。
ミヌティエン昆虫ピン、0.10 mm	ファインサイエンスツール	26002-10	大動脈弓のピン留め用。
パラフィルムM	ビーミス	PM992	大動脈弓のピン留めベッドを作成するために使用されるパラフィンワックスフィルム。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	-	-	マウスの灌流には無菌でRNaseフリーの溶液が必要です
実体顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	MZ6	解剖および顔面の文書化用
スーダンIV	シグマ・アルドリッチ	S4261	有害物質または混合物として分類されていない。
バンナスハサミ(8cm、ストレート)	世界の精密機器	503378	大動脈のマイクロダイセクション用。

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