リグニンを可視化するためのWiesner染色:シロイヌナズナの茎に存在するリグニン沈着物を染色する技術

要約

出典:Pradhan Mitra, P. et al., Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements. J. Vis. Exp. (2014).

このビデオでは、特殊な植物細胞に存在するリグニンを染色するためのWiesner染色技術について説明します。この染色技術は、シロイヌナズナの茎の木質化した細胞壁を視覚化するのに役立ち、さまざまな種類の細胞の細胞壁の木質化を定量化するのに役立ちます。

プロトコル

1. 語幹の埋め込み

1. 7%アガロース溶液を水で調製します(100 mLの蒸留水に7 gの電気泳動グレードのアガロースを入れます)。アガロースを20分間オートクレーブするか、最低強度(例:1,250ワットのマイクロ波の10%強度)で20分間
電子レンジで溶解します。
2. プラスチック製のバイアルを使用して茎を埋め込むための自家製の型を準備します。
   1. かみそりの刃を使用して、2 mlのスクリューキャップマイクロ遠心チューブ(パートA)の円錐形の底を切り取ります。シリンジ針で、埋め込むステムの直径より少し大きいチューブキャップに穴を開けます。次に、0.6 mLの微量遠心チューブ(パートB)の底から0.5 cmを切り取ります。
   2. 0.6 mLの微量遠心チューブの0.5 cmのカットオフ部分を、あらかじめカットした2 mLの微量遠心チューブに加えます。パラフィルムを使用して2つの部品をシールします(図1).
      手記：チューブの底部は、アガロースが固まった後に埋め込まれたサンプルの除去を容易にするためにカットされています。キャップの穴は、ステムがアガロースに埋め込まれているときにステムを安定させるのに役立ちます。型は、埋め込むときにアガロースを保持し、ステムをまっすぐ保持する役割を果たします。パラフィルムは、アガロースがセットされ、ステムが埋め込まれるまで、AとBの2つの部分を保持します。
   3. カミソリの刃を使用して、関心のある領域からステムセクションを切り取ります(例:最初のステムノード間の中央).
      手記： 理想的には、脱水による破壊を避けるために、埋め込む直前に茎を切る必要があります。あるいは、ステムを水で濡らした濾紙を入れたプレートに一時的に保管することもできます。このプレートは、組織の脱水や変形を防ぐために、埋め込む準備ができるまで氷の上に置くことができます。水分を多く含まずにステムを30分以上保管すると、ステムが乾燥します。
3. アガロースを電子レンジで低強度で溶かします.
   注意：アガロースの入ったボトルは熱い場合があります。ミットを使用してボトルを拾います。溶かしたアガロースを室温(20°Cから25°C)で約50°Cに冷えるまで放置します。
ア
4. ガロース5mlを既製のプラスチック型にゆっくりとピペットで入れ、バイアルを満たします.
   手記：金型に気泡がないことを確認してください。気泡はアガロース型に隙間を生じさせ、ステムサンプルを完全に覆うことができず、最終的にはサンプルセクションの切断が不均一になります。
   1. アガロースを30〜60秒間冷まして半固体にします。小さなつまようじでテストし、アガロースに浸透して立ち上がることができるが、浮かばないことを確認します.
      手記：アガロースがまだ熱いときにステムを配置すると、ステムが縮むことでサンプルが損傷し、細胞の形態が破壊されます。
   2. このアガロースで満たされたバイアルにステムを置きます。ステムがまっすぐに保たれていることを確認してください。穴あきキャップを、ステムの先端がキャップに保持されるように配置します。ねじ込み式キャップを回さないでください。場合によっては、1つのバイアルに複数のステム(1種類の)を埋め込むことができます。ただし、その場合は cap.
      を使用しないでください 手記：ねじ込み式キャップを回すとステムがねじれます。
5. バイアルを室温または4°Cで10〜30分間、固まるまで放置します。
6. 金型をチューブからそっとスライドさせて取り外します。パラフィルムを開きます。金型のパーツBの底を親指でそっと押して、固化したアガロースをパーツAからガラス顕微鏡スライドに放出します。
7. アガロースに埋め込まれた茎を、長さ1.2cmのほぼ等しい3つの部分に切ります。茎のうちアガロースになかった部分を切り取り、捨てます。
   1. ステムが埋め込まれたこれらのアガロース片は、密閉された2 mLの微量遠心チューブに、切片を作る準備ができるまで4°Cの暗所に保管します。あるいは、チューブを4°Cで最大1週間保存します
      手記：保存することは可能ですが、実験者は、埋め込まれたステムがまだ生きており、実験によってはアーティファクトが持ち込まれる可能性があることを認識する必要があります。

2. ステムセクショニング

>注意:ビブラートのマニュアルを注意深く読み、すべての安全指示に従ってください。

1. 試料ディスクが清潔で完全に乾燥している(固体や液体がない)ことを確認してください。カミソリの刃で試料ディスクを洗浄し、以前の実験で残った接着剤を取り除き、水で洗います。その後、ペーパータオルで乾かします.
   手記：これにより、接着剤がうまく機能し、アガロース試料に結合することが保証されます。このステップが適切に行われないと、試験片がディスクに付着せず、後で切片化中に試験片がディスクから脱落する可能性があります。
   1. 柔らかいペーパーワイプを使用して、標本を含むアガロースブロックから水分を取り除きます。
   2. 標本ディスクに組織接着剤を少量垂らし、接着剤ボトルの先端を使用してプレートの中央の領域を覆うように接着剤を縞で押し出します。アガロースブロックをすばやく配置して、試験片がプレートに対して垂直または平行になるようにして、横方向または縦方向の断面をそれぞれ取ります。接着剤でサンプルを室温または4°Cで10〜30分間試料ディスクに固定します。
2. 試料ディスクをバッファートレイまたはトラフの所定の位置に固定します。アガロースのブロックとセクションは、かみそりの刃と平行になっている必要があります。サンプルが完全に沈むまで、バッファートレイに室温の蒸留水を入れます。
3. かみそりの刃を半分に切り、刃が完全に平らになるように頑丈なはさみで端を切り取ります。プレカットされたカミソリの刃の半分をナイフホルダーに取り付けます。
   1. ナイフホルダーの角度を84°に、速度を0.90 mm /秒(ビブラトームの位置8)に、周波数を50 Hz(ビブラトームの位置5)に設定します。厚さ100μmの切片を切断します。連続モードを使用します。手記：この厚さは、組織が一部の染色プロトコルで使用されるさまざまな酸および塩基処理に耐えられることを保証するために選択されました。セクショニング用のウィンドウを設定し、ビブラトームが約1.2cmのアガロースブロックをセクショニングするための連続モードで15〜20分を許可します。
4. 使い捨てのプラスチックピペットを使用して、バッファートレイでの切片作成中に切片を収集します。あるいは、セクションをバッファートレイからガラスビーカーに移し、次に透明なペトリプレートに移すこともできます。いくつかの切片を2.0 mLの微量遠心チューブに移します。注:試料は、鮮明な背景で切片が見やすく、バッファトレイを次の試料のためにプライミングできるため、ペトリプレートから採取されます。
5. 切片は、50mlのチューブに保管するか、または回収して1.5〜2mlの微量遠心チューブに4°Cで30〜60分間保存することができます
   手記：切片を長期間保存すると、画質が低下します。

3. フロログルシノール-HCl(Wiesner)染色

1. 0.3gのフロログルシノールを10mlの無水エタノールに溶解して、3%フロログルシノール溶液を調製します。1容量の濃縮HCl(37N)をエタノール中の2容量の3%フロログルシノールに混合します。この溶液は、フロログルシノール-HCl(Ph-HCl)またはWiesner染色です.
   手記：この溶液は染色当日に新鮮に作られ、溶液が時間の経過とともに劣化し、染色が効果がなくなるため、保存することはできません。
   注意：HClは腐食性が高いため、Ph-HCl染色の取り扱いには細心の注意を払ってください。
2. ステム切片を2.0 mLの微量遠心チューブに移します。切片を含むチューブにPh-HCl溶液1 mLを加え、Ph-HCl染色中のHClは非常に腐食性が高いため、すぐにキャップを閉めます。チューブをゆっくりと動かして、すべてのセクションが汚れていることを確認します。このステップの代替手段は、チューブキャップを開いたままにして、Ph-HCl溶液を、できれば切片を乱さずに上下にピペッティングできるようにすることです
   手記：セクションをピペットチップにピペットで挿入しないように注意してください。
   1. 1mlのピペットは、切片を傷つけずに簡単にピペットで取り出せるようにピペットの先端をカットした状態でご使用ください。切片をチップにそっとピペットで入れ、顕微鏡スライドに取り付けます。セクションをカバースリップで覆います。明視野照明下のセクションを観察します。(図2)
      手記： Ph-HCl溶液は5〜10分で乾燥し、試料の劣化を引き起こします。したがって、イメージングはその期間内に完了する必要があります。

結果

図1.ステムを埋め込むための自家製の型。左側にあります。2 mL スクリューキャップマイクロ遠心チューブの上部 (パート A) と 0.6 ml マイクロ遠心チューブの下部 (パート B)。右側にあります。パラフィルムは2つの部分を保持しています。AとBが最終型を形成します。

図2. A. thaliana茎断面のフロログルシノール-HCl染色。野生型A.thaliana茎切片のフロログルシノール-HCl染色(ピンク色またはフクシア色)は、束間繊維および木部細胞(A-E)の壁に正常なリグニン沈着を示しています。表皮と皮質(Ep...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	EMDの	MERC2125	CAS番号:9012-36-6
フロログルシノール	シグマ	P 3502	1,3,5-トリヒドロキシベンゼン[CAS番号:108-73-6]
塩酸	EMDの	HX0603-75	CAS番号:7647-01-0
エタノール190プルーフ	コプテック	V1401	CAS番号:64-17-5
ビブラトーム	ライカ	ライカ バイブレーションブレード ミクロトーム VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ 製品/切片/振動ブレード-ミクロトーム/詳細/製品情報/ライカ-VT1000-S/
剃刀	アメリカの安全かみそり会社	アイテム # 60-0139-0000	ステンレスダブルエッジブレード(ペルソナスーパー)
スクリューキャップマイクロ遠心チューブ(2 ml)	VWRの	16466-044
微量遠心チューブ(0.6 ml)	アクシゲン・サイエンティフィック	MCT-060-Cの
ティッシュ接着剤	テッド・ペラ・インク	10033	4°Cまたは20°Cで3か月以上保存
メカニカルシャッターのないCCDチップ付きカメラ	浜松	C4742-95
カメラソフトウェア	分子デバイス	MetaMorph バージョン 7.7.0.0
アナリシスの想像	アドービ	フォトショップCS4
マイクロカバーグラス スクエア No.1	VWRの	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-カバーガラスは耐腐食性があります
つや消しマイクロスライド、1 mm	VWRの	〒48312-003	75 x 25 mm - 1 mm