Calcofluor白色染色:双子葉植物の茎切片の細胞壁におけるセルロース沈着物のUV誘起蛍光可視化のための簡単な方法

要約

出典:Pradhan M. et al.シロイヌナズナ二次細胞壁要素の組織化学的染色。J. Vis. Exp.(2014年)

このビデオでは、双子葉植物であるシロイヌナズナの細胞壁内にセルロース沈着を可視化する染色手順を、β結合グルカンに特異的に結合し、紫外線下で蛍光を示すcalcofluor whiteを用いて説明します。

プロトコル

1. 語幹の埋め込み

1. 7%アガロース溶液を水で調製します(100 mLの蒸留水に7 gの電気泳動グレードのアガロースを入れます)。アガロースを20分間オートクレーブするか、最低強度(例:1,250ワットのマイクロ波の10%強度)で20分間電子レンジで溶解します。
2. プラスチック製のバイアルを使用して茎を埋め込むための自家製の型を準備します。
   1. かみそりの刃を使用して、2 mlのスクリューキャップマイクロ遠心チューブ(パートA)の円錐形の底を切り取ります。シリンジ針で、埋め込むステムの直径より少し大きいチューブキャップに穴を開けます。次に、0.6 mLの微量遠心チューブ(パートB)の底から0.5 cmを切り取ります。
   2. 0.6 mLの微量遠心チューブの0.5 cmのカットオフ部分を、あらかじめカットした2 mLの微量遠心チューブに加えます。パラフィルムを使用して2つの部品をシールします(図1).
      注:チューブの底は、アガロースが固まった後に埋め込まれたサンプルの除去を容易にするためにカットされています。キャップの穴は、ステムがアガロースに埋め込まれているときにステムを安定させるのに役立ちます。型は、埋め込むときにアガロースを保持し、ステムをまっすぐ保持する役割を果たします。パラフィルムは、アガロースがセットされ、ステムが埋め込まれるまで、AとBの2つの部分を保持します。
   3. カミソリの刃を使用して、関心のある領域からステムセクションを切り取ります(例:最初のステムノード間の中央).
      注:理想的には、脱水による破壊を避けるために、埋め込む直前に茎を切る必要があります。あるいは、ステムを水で濡らした濾紙を入れたプレートに一時的に保管することもできます。このプレートは、組織の脱水や変形を防ぐために、埋め込む準備ができるまで氷の上に置くことができます。水分を多く含まずにステムを30分以上保管すると、ステムが乾燥します。
3. アガロースを電子レンジで低強度で溶かします.
   注意:アガロースが入ったボトルは熱い場合があります。ミットを使用してボトルを拾います。溶かしたアガロースを室温(20°Cから25°C)で約50°Cに冷えるまで放置します。
ア
4. ガロース5mlを既製のプラスチック型にゆっくりとピペットで入れ、バイアルを満たします.
   注意: 金型に気泡がないことを確認してください。気泡はアガロース型に隙間を生じさせ、ステムサンプルを完全に覆うことができず、最終的にはサンプルセクションの切断が不均一になります。
   1. アガロースを30〜60秒間冷まして半固体にします。小さなつまようじでテストし、アガロースに浸透して立ち上がることができるが、浮かばないことを確認します.
      注:アガロースがまだ熱いときにステムを配置すると、ステムがしわ寄ってサンプルが損傷し、細胞の形態が破壊されます。
   2. このアガロースで満たされたバイアルにステムを置きます。ステムがまっすぐに保たれていることを確認してください。穴あきキャップを、ステムの先端がキャップに保持されるように配置します。ねじ込み式キャップを回さないでください。場合によっては、1つのバイアルに複数のステム(1種類の)を埋め込むことができます。ただし、その特定の場合は、cap.
      を使用しないでください 注意: ねじ込み式キャップを回すと、ステムがねじれます。
5. バイアルを室温または4°Cで10〜30分間、固まるまで放置します。
6. 金型をチューブからそっとスライドさせて取り外します。パラフィルムを開きます。金型のパーツBの底を親指でそっと押して、固化したアガロースをパーツAからガラス顕微鏡スライドに放出します。
7. アガロースに埋め込まれた茎を、長さ1.2cmのほぼ等しい3つの部分に切ります。茎のうちアガロースになかった部分を切り取り、捨てます。
   1. ステムが埋め込まれたこれらのアガロース片は、密閉された2 mLの微量遠心チューブに、切片を作る準備ができるまで4°Cの暗所に保管します。あるいは、チューブを4°Cで最大1週間保存します
      注:保管は可能ですが、実験者は埋め込まれたステムがまだ生きており、実験によってはアーティファクトが持ち込まれる可能性があることを認識する必要があります。

2. ステムセクショニング

>注意:ビブラトームのマニュアルを注意深く読み、すべての安全指示に従ってください。

1. 試料ディスクが清潔で完全に乾燥している(固体や液体がない)ことを確認してください。カミソリの刃で試料ディスクを洗浄し、以前の実験で残った接着剤を取り除き、水で洗います。その後、ペーパータオルで乾かします.
   注:これにより、接着剤がうまく機能し、アガロース試料に結合することが保証されます。このステップが適切に行われないと、試験片がディスクに付着せず、後で切片化中に試験片がディスクから脱落する可能性があります。
   1. 柔らかいペーパーワイプを使用して、標本を含むアガロースブロックから水分を取り除きます。
   2. 標本ディスクに組織接着剤を少量垂らし、接着剤ボトルの先端を使用してプレートの中央の領域を覆うように接着剤を縞で押し出します。アガロースブロックをすばやく配置して、試験片がプレートに対して垂直または平行になるようにして、横方向または縦方向の断面をそれぞれ取ります。接着剤でサンプルを室温または4°Cで10〜30分間固定します
      注:これは時間的制約のある手順です。
2. 試料ディスクをバッファートレイまたはトラフの所定の位置に固定します。アガロースのブロックとセクションは、かみそりの刃と平行になっている必要があります。サンプルが完全に沈むまで、バッファートレイに室温の蒸留水を入れます。
3. かみそりの刃を半分に切り、刃が完全に平らになるように頑丈なはさみで端を切り取ります。プレカットされたカミソリの刃の半分をナイフホルダーに取り付けます。
   1. ナイフホルダーの角度を84°に、速度を0.90 mm /秒(ビブラトームの位置8)に、周波数を50 Hz(ビブラトームの位置5)に設定します。厚さ100μmの切片を切断します。連続モードを使用します。.
      注:この厚さは、組織が染色プロトコルの一部で使用されるさまざまな酸および塩基処理に耐えられることを保証するために選択されました。セクショニング用のウィンドウを設定し、ビブラトームが約1.2cmのアガロースブロックをセクショニングするための連続モードで15〜20分を許可します。
4. 使い捨てのプラスチックピペットを使用して、バッファートレイでの切片作成中に切片を収集します。あるいは、セクションをバッファートレイからガラスビーカーに移し、次に透明なペトリプレートに移すこともできます。いくつかの切片を2.0mlの微量遠心チューブに移します.
   注:標本は、鮮明な背景で切片が見やすく、バッファトレイを次の試料のために下塗りできるため、ペトリプレートから収集されます。
5. 切片は、50mlのチューブに保管するか、または回収して1.5〜2mlの微量遠心チューブに4°Cで30〜60分間保存することができます
   注意: セクションを長期間保存すると、画質が低下します。

3. カルコフローホワイト染色

1. 0.02 gの蛍光増白剤28(calcofluor white M2R)を10 mLの蒸留水に溶解し、0.2%ストック溶液を調製します。0.2%溶液は、4°Cの暗いボトルで6ヶ月間保存でき、0.2%ストック溶液を蒸留水で10倍に希釈することにより、0.02%の作業溶液を調製します。
2. ステム切片を2.0 mLの微量遠心チューブに移します。0.02%calcofluor白色溶液をチューブ1mlに加える。0.02%カルコフルーオロ白色溶液を上下に静かにピペットで動かします.
   注意: セクションをピペットチップにピペットで挿入しないように注意してください。
   1. 室温で5分間インキュベートし、ピペッティングを繰り返します。切片を室温でさらに3分間インキュベートします
      注意: セクションがチューブの底に落ち着くのを待って、セクションを損傷することなく溶液をピペットで取り出しやすくします。
   2. 1 mLのピペットを使用して、0.02% calcofluor白色溶液700 μlを取り出し、蒸留水700 μlを加えます。5分間待ってからcalcofluor白色溶液を洗い流してください。洗濯を3〜4回繰り返します。1mlのピペットは、切片を傷つけずに簡単にピペットで取り出せるように、ピペットの先端をカットして使用してください。
   3. 切片をチップと顕微鏡スライドにそっとピペットで入れ、カバースリップで覆います。UVライトの下でセクションを観察します。

結果

図 1.茎を埋め込むための自家製の型。左側にあります。2 mL スクリューキャップマイクロ遠心チューブの上部 (パート A) と 0.6 ml マイクロ遠心チューブの下部 (パート B)。右側にあります。パラフィルムは2つの部分を保持しています。AとBが最終型を形成します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	EMDの	MERC2125	CAS番号:9012-36-6
蛍光増白剤28/カルコフローホワイトステイン	シグマ	F3543	4,4'-ビス[[4-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-6-アニリノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]アミノ]スチルベン-2,2'-ジスルホン酸[CAS番号4404-43-7]
ビブラトーム	ライカ	ライカ バイブレーションブレード ミクロトーム VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
剃刀	アメリカの安全かみそり会社	アイテム # 60-0139-0000	ステンレスダブルエッジブレード(ペルソナスーパー)
スクリューキャップマイクロ遠心チューブ(2 ml)	VWRの	16466-044
微量遠心チューブ(0.6 ml)	アクシゲン・サイエンティフィック	MCT-060-Cの
ミット	ベルアート	3800000000	SCIENCEWARE ホットハンドプロテクターミット
ティッシュ接着剤	テッド・ペラ・インク	10033	4°Cまたは20°Cで3か月以上保存
マイクロ波	パナソニック	NN-SD762Sの	PELCO Pro CA 44インスタントティッシュ接着剤
マイクロカバーグラス スクエア No.1	VWRの	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-カバーガラスは耐腐食性があり、均一に厚く平らです。No.1の厚さは0.13〜0.17mmです。
つや消しマイクロスライド、1 mm	VWRの	〒48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
パラフィルムM	アルカン包装	BRNDPM998