方法論記事

陰イオン交換クロマトグラフィーベースのタンパク質精製:正味電荷に基づいて透析細菌溶解物から目的のタンパク質を単離する分離技術

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Fuehner, S., et al. 免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘導オリゴマーの精製 J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオでは、大腸菌培養物からのタンパク質の正味表面電荷に基づいてヒトカルシウム結合タンパク質S100A12を精製する陰イオン交換クロマトグラフィー技術を示しています。

プロトコル

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1. タンパク質の精製

  1. 陰イオン交換クロマトグラフィー
    1. 透析
      1. 20 mM Tris、1 mM EDTA、1 mM エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸(EGTA)を脱イオン水に溶解し、HClでpHを8.5に調整して、陰イオン交換クロマトグラフィー(AIEX)バッファーAを調製します。透析用には2 x 5 L、クロマトグラフィー用にはAIEXバッファーA.
        2 x 1 Lを調製します。 手記：透析液の量は、サンプル量の約100倍にする必要があります。クロマトグラフィーに使用するすべてのバッファーは、ろ過(0.45 μm以下)および脱気(超音波浴または真空脱気など)する必要があります。
      2. 透析チューブ(分子量カットオフ[MWCO]:3.5 kDa)を適切な長さに切断し、回転攪拌子の上にサンプルの浮力を確保するために、空気用のスペースを追加します
        手記：グリセロールはメンブレンを保存するため、使用前に除去する必要があります。
      3. 透明化したタンパク質溶液の粘度を下げるには、溶液を25 mLのAIEXバッファーAで希釈して、その後のクロマトグラフィーカラムへの適用を容易にします。最初のクロージャーをチューブに取り付け、サンプルをメンブレンにロードし、2番目のクロージャーをチューブの上端から少なくとも1 cmのところに取り付けます。
      4. AIEXバッファーAを入れた5L容器を攪拌板に置き、攪拌子とタンパク質溶液を充填したメンブレンを加えます。回転する攪拌子との干渉を避けて、サンプルを回転させる速度を調整します。4°Cで12-24時間透析し、透析液バッファー(AIEXバッファーA)を新しい予冷調製物に交換し、少なくともさらに4時間継続します。透析したタンパク質溶液を50mLチューブに移し、0.45μmフィルターユニットでろ過します><。 手記：収納可能。
    2. クロマトグラフィー
      1. 液体クロマトグラフィーシステム(FPLC)を一般的なメンテナンスで起動し、カラムバッファーAIEX AおよびAIEX B(1 M NaClを含むAIEXバッファーA)と陰イオン交換樹脂含有カラムを接続します。一般的なクロマトグラフィーパラメーターについては、表 1 を参照してください
        手記：バッファー、カラム、FPLC装置は、分析を開始する前に同じ温度に平衡化する必要があります(表1、表2のクロマトグラフィーパラメーターを参照)。
      2. カラムをAIEXバッファーAで平衡化し、続いてサンプルをカラムにロードし、0%から100%の高塩バッファー(AIEX B)の線形グラジエントでタンパク質を溶出します。詳細なメソッドプロトコールについては、表2を参照してください。
      3. 溶出中に2 mLのフラクションを回収し、クマシー染色した15%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で各フラクション10 μLを分析します。透析のためにS100A12タンパク質を含む画分をプールします.
        手記：S100A12の分子量は10,575 Daです。

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結果

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>表1:陰イオン交換クロマトグラフィーの適用パラメータに関する詳細情報。

ベッド容量(CV)75ミリリットル
モニター280 nMでの吸光度
最大圧力3バール
カラムバッファ A20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、pH 8.5
カラムバッファB20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 M NaCl、pH 8.5
サンプル量<...

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
25% HCl カール・ロス X897.1
4−20% ミニプロティアン TGX プロテインゲル バイオラッド 4561093
クーマシーブリリアントブルーR250脱染ソリューション バイオラッド 1610438
クマシーブリリアントブルーR250染色液 バイオラッド 1610436
EDTA二ナトリウム塩二水和物 カール・ロス 8043.1
EGTA カール・ロス 3054.3
Q セファロース高速フロー GEヘルスケア 17-0510-01 陰イオン交換クロマトグラフィー用樹脂
塩化ナトリウム(NaCl) カール・ロス 3957.2
水酸化ナトリウム カール・ロス P031.1
トリスベース カール・ロス 4855.3
0.45 µmシリンジフィルター メルク SLHA033SS
5 L 計量ビーカー カール・ロス CKN3.1
50 mL円錐形遠心チューブ コーニング 430829
透析チューブクロージャー スペクトラム 132738
フラクションコレクターチューブ5mL グライナー 115101
スペクトル/POR透析膜(3.5 kDa)スペクトル 132724
ステリトップフィルターユニット メルク SCGPT01RE
ÄKTA清浄機 UPC 10 GEヘルスケア FPLCシステム
フラクションコレクター GEヘルスケア Frac-920
ミニプロティアンテトラセル バイオラッド 1658000EDU
ナノフォトメーター 実装 P330
pHメーター ニック 765

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タグ

FPLC

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