カルシウム依存性疎水性相互作用クロマトグラフィー:疎水性相互作用に基づくカルシウム結合タンパク質の精製技術

要約

出典:Fuehner, S., et al., Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation.J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、カルシウム依存性疎水性相互作用クロマトグラフィーを通じて、透析細胞溶解物からカルシウム結合タンパク質を精製する方法を示します。カルシウム結合タンパク質は、カルシウムと結合すると疎水性領域を露出させ、樹脂上の疎水性基との相互作用を促進します。その後、これらのタンパク質は、相互作用を逆転させるカルシウムキレート剤EDTAを使用して溶出されます。

プロトコル

1. カルシウム依存性疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)

1. 透析
   1. タンパク質溶液を 20 mM Tris、140 mM NaCl、pH 7.5 に対して透析
   します。
2. クロマトグラフィー
   1. 20 mM Tris、140 mM NaCl、25 mM CaCl2 を脱イオン水に溶解して 1 L のクロマトグラフィーバッファー HIC A を調製し、pH を 7.5 に調整します。HICバッファーBについては、20 mM Tris、140 mM NaCl、および50 mM EDTAを溶解します。pHを7.0に調整し、バッファーをろ過して脱気します。CaCl2を最終濃度25 mMまでサンプルに加え、0.45 μmでろ過します。HICバッファーとサンプルを4°C(カラム温度)に平衡化します。
   2. 一般的なメンテナンスで液体クロマトグラフィーシステムを起動し、カラムバッファーHIC AおよびBとカラムを接続します。その他のクロマトグラフィーパラメーターについては、表 1 を参照してください。
   3. カラムを平衡化し、サンプルをロードし、UV シグナルが再びベースラインレベルに達するまで「未結合サンプルの洗浄」ブロックを拡張します。次に、カルシウムキレート剤含有バッファー(EDTA)で溶出を開始します。詳細なメソッドプロトコルについては、表2を参照してください。
      手記：これまでの実験では、カルシウムの過剰摂取がS100A12のクロマトグラフィー樹脂への結合に有益であると考えられていることが示されています。
   4. 2 mLのピークフラクションを収集し、各フラクション10 μLをクマシー染色した15% SDS-PAGEで分析します。純粋なS100A12画分をプールし、Hepes緩衝生理食塩水(HBS;20 mM Hepes、140 mM NaCl、pH 7.0)に対して透析します
      手記：モノマー S100A12の吸光係数は2980 M-1 cm-1です。

結果

>表1:疎水性相互作用クロマトグラフィーの適用パラメータに関する詳細情報。

ブロック	容積	バッファ	出口
平衡	1−2カラム容量(CV)	ある	浪費
サンプルロード	該当なし	ある	浪費
未結合のサンプルを洗い流す	1−2 履歴書

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケミカル
EDTA二ナトリウム塩二水和物	カール・ロス	8043.1
フェニルセファロース高性能	GEヘルスケア	17-1082-01	疎水性相互作用クロマトグラフィー用樹脂
塩化ナトリウム(NaCl)	カール・ロス	3957.2
水酸化ナトリウム	カール・ロス	P031.1
トリスベース	カール・ロス	4855.3
25%HCl	カール・ロス	X897.1
カルシウム塩素二水水産物	カール・ロス	5239.1
実験器具
0.45 μm シリンジフィルター	メルク	SLHA033SS
14 mL丸底チューブ	BDの	352059
2L三角フラスコ	カール・ロス	LY98.1
フラクションコレクターチューブ 5 mL	グライナー	115101
Spectra/Por 透析膜 (3.5 kDa)	スペクトル	132724
ステリトップフィルターユニット	メルク	SCGPT01RE
備品
フラクションコレクター	GEヘルスケア	フラック-920