ニッケルアフィニティークロマトグラフィーベースのタンパク質精製:細菌細胞溶解物からポリヒスチジンタグ付き組換えタンパク質を精製する技術

要約

出典:Pokhrel, A. et al. クロストリジウム・ディフィシル由来の(p)ppGpp合成酵素の精製およびIn Vitro活性アッセイ。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、クロストリジウム・ディフィシル菌からヒスチジンタグ付きピロホスホキナーゼ酵素を精製するニッケル親和性クロマトグラフィー技術を実演します。

プロトコル

1. ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製

1. 重力カラム上で1 mLのニッケル-ニトリロ酢酸(Ni-NTA)樹脂を使用してタンパク質を精製します。
   1. 使用前日に、2 mL の平衡緩衝液(10 mM Tris-HCl pH 7.79、300 mM NaCl、50 mM NaH₂PO₄、0.5 mg/mL リゾチーム、5 mM MgCl₂、10 mM イミダゾール、0.25 mM DTT、5 mM フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)、10% グリセロール)を用いてカラムを 4 °C で一晩平衡化します。
   2. 翌日、カラムを4°Cから室温まで移動させてから、清澄化したライセートをロードし、~2〜3時間放置します
      手記：カラムを熱平衡状態にすることは、カラム内に気泡が形成されるのを防ぐために重要です。
   3. ペレットを溶解バッファー(10 mM Tris-HCl pH 7.8、300 mM NaCl、5 mM MgCl₂、50 mM NaH₂PO₄、10%グリセロール、0.5 mg/mLリゾチーム、10 mMイミダゾール、0.25 mM DTTおよび5 mM PMSF)に再懸濁します。
   4. 氷上で細胞を8 x 10秒間隔で超音波処理し、パルス間で30秒一時停止します。
   5. 微量遠心分離機を用いて、3,080 x g、4°C、30分間遠心分離することにより、ライセートを清澄化します。
   6. 等量の溶解バッファーでライセートを調製し、調製した清澄化ライセートをカラムに適用し、フロースルーを回収します。
   7. 清澄化したライセートのフロースルーをカラムに再適用し、二次フロースルーを回収します。
   8. カラムを洗浄バッファー 1(10 mM Tris-HCl (pH 7.79)、300 mM NaCl、5 mM MgCl₂、50 mM NaH₂PO₄、30 mM イミダゾール、10% グリセロール)で洗浄します。フロースルー.
      を収集します 注:洗浄バッファーおよび溶出バッファーに5 mM MgCl₂を含有させることは、精製タンパク質の酵素活性にとって重要です。
   9. カラムを洗浄バッファー 2(10 mM Tris-HCl (pH 7.79)、300 mM NaCl、5 mM MgCl₂、50 mM NaH₂、PO₄、および 50 mM イミダゾール)で洗浄します。
   10. フロースルーを収集します。
   11. 2 mLの溶出バッファー(10 mM Tris-HCl(pH 7.79)、300 mM NaCl、50 mM NaH₂PO₄、10%グリセロール、75 mMイミダゾール)を添加します。フロースルーをそれぞれ1 mLの2つのフラクションで回収します。
       手記：このステップ後のカラムは、次の精製アッセイで同じタンパク質を精製する場合、4°Cの平衡化バッファーに保存できます。カラムは、適切に保管すれば最大3回まで使用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ni-NTA樹脂	Gバイオサイエンス	786-940/941
Pierce Disposable Gravityカラム、10 mL	サーモサイエンティフィック	29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2透析装置(MWCO:20-kD)	スペクトル	G235033
超音波プロセッサ	ソニックス	VC-750
D3024/D3024Rローター付き微量遠心分離機	シロゲックス