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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マイコバクテリアからの非共有結合脂質の抽出(図1)
- 固体培地から0.2 gのマイコバクテリアを掻き取り、ポリテトラフルオロエトレン(PTFE)ライナースクリューキャップ付きのガラス管に加えます。5 mLのクロロホルムと10 mLのメタノール(クロロホルム:メタノール、1:2)からなる溶液を加えます。
手記：有機溶剤を使用する場合は、ガラス受給者のみを使用してください。プラスチック容器は許可されていません。また、ボトル用のPTFEライナースクリューキャップが必要です.
注意：クロロホルムは潜在的に有毒で非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：メタノールは潜在的に有毒で非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
- チューブを一晩中絶えず攪拌したままにして、マイコバクテリア細胞表面から非共有結合脂質を抽出します.
手記：軌道振とうプラットフォームが利用できない場合は、一定の攪拌をできるだけ頻繁に定期的な手動攪拌に置き換えることができます。
- ガラス漏斗を濾紙で覆い、有機溶剤をろ過し、ガラス管に集めます。
- 窒素ガスフラックスを使用して、チューブ内の液相を蒸発させます。チューブに窒素ガスを充填し、蓋をして4°C.
で保管します
手記：ガラス製のパスツールピペットを窒素ガスの流れに接続して、目的のチューブを特別に蒸発させます。さらに、チューブ用のドライブロックヒーター内のチューブを37°Cに維持します。溶媒が蒸発したら、チューブを閉じる前に窒素ガスをチューブに充填します。
- クロロホルム:メタノール(2:1)の溶液15mLを細胞残骸に加えます。チューブを一晩中絶えず攪拌したままにして、マイコバクテリア細胞表面から非共有結合脂質を抽出します.
手記：軌道振とうプラットフォームが利用できない場合は、一定の攪拌をできるだけ頻繁に定期的な手動攪拌に置き換えることができます。
- 混合物を1時間休ませます。パスツールピペットで有機溶媒を回収します。ガラス漏斗を濾紙で覆い、有機溶剤をろ過し、手順1.3で以前に使用したのと同じガラス管に収集します。窒素ガスフラックスを使用して、チューブ内の液相を蒸発させます。チューブに窒素ガスを充填し、閉じて再度4°Cで保管します。
2. 酸メタノール分解によるミコール酸抽出(図2A)
- 2〜5mLのエステル化溶液をPTFEライナースクリューキャップ付きの密閉ガラス管に加えます。ガラス管に0.2gのマイコバクテリアバイオマスを加えます.
手記：エステル化溶液は、メタノール30mL、トルエン15mL、硫酸1mLを混合して形成されます。マイコバクテリア細胞は、固体培養物から、またはマイコバクテリア(ステップ1.6でろ過した後の残りの細胞)から共有結合脂質全体を抽出した後、脱脂質細胞からも採取できます
注意：トルエンは可燃性で非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：硫酸は腐食性で危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
- ボルテックスで内容物を混合します。混合物を80°Cのドライバス内に一晩放置します。
- チューブが室温に達するまで冷ましてから、チューブに2mLのn-ヘキサンを加えます。内容物を30秒間ボルテックスして混合し、2つの透明な相が現れるまでチューブを沈殿させます。
注意:n-ヘキサンは、可燃性、刺激性、環境に有害で、非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
- n-ヘキサン相に対応する上相を回復します。新しいチューブに移します。
- 手順2.3を繰り返します。上相を再度回復し、手順2.4で使用したのと同じチューブに移します。
- 窒素ガスフラックスを使用してチューブの内容物を蒸発させます。チューブに窒素ガスを充填して閉じ、4°Cで保存します。
3. 鹸化とメチル化によるミコール酸抽出(図2B)
- 固体培地から0.2gのマイコバクテリアを引っ掻き取り、PTFEスクリューキャップでガラス管に加えます。
- 5%水酸化カリウムを含む2mLのメタノール-ベンゼン溶液(80:20)を加えます。ボルテックスで内容物を混合します。混合物を100°C.
で3時間加熱します
注意：ベンゼンは可燃性、発がん性、および危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
- チューブを室温まで冷まします。20%硫酸を加えてサンプルを酸性化し、pH = 1を達成します。
- ジエチルエーテル3mLを加えます。ボルテックスで内容物をやさしく混ぜます。
- 落ち着くことによって2つのフェーズを形成させます。ジエチルエーテル相を回収し、新しいチューブに移します。洗浄手順を合計3回繰り返します。
- ジエチルエーテル抽出物を2mLの蒸留水で洗浄し、ジエチルエーテルに対応する上部を新しいチューブに移します。洗浄手順を合計3回繰り返します。
- ジエチルエーテル抽出物の上に無水硫酸ナトリウム2gを加えて乾燥させます。
- サスペンションをフィルタリングします。窒素ガスフラックスを使用して内容物を蒸発させます。
- メチル化ステップを実行するには、蒸留水に45 mLのジエチルエーテルと9 mLの40%KOHで形成された予冷溶液に3 gのN-ニトロソ-N-メチル尿素を溶解します><。
注意：N-ニトロソ-N-メチル尿素は、毒性、刺激性、発がん性、および危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
- 上清(ジアゾメタン)を、水酸化カリウムペレット(約30g)を含む氷で冷却した新しいフラスコに移します
手記：上清をすぐに使用しない場合は、-20°Cで最大1時間保存できます
注意：水酸化カリウムペレットは刺激性で腐食性の物質です。この材料は、適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用した層流フードで使用する必要があります。
注意：ジアゾメタンは毒性が高く、爆発の可能性があります。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用した安全ガラス付きの層流フードで使用する必要があります。
- ステップ3.10で得られたジアゾメタンを含むエーテル溶液2mLを、ステップ3.8で得られたミコール酸を含む乾燥ジエチルエーテル抽出物に加えます。室温で15分間インキュベートします。
- 懸濁液を40°Cで蒸発させ、チューブに窒素ガスを充填して閉じ、メチル化脂質を4°Cで保存します
手記：層流フードの下のエーテル溶液からジアゾメタンを蒸発させ、エーテルが黄色を失うまで 蒸発させます。
4. 薄層クロマトグラフィー(TLC)分析
- ガラスTLCチャンバーを飽和させます。これを行うには、TLCチャンバーの壁の1つを濾紙で覆い、溶媒の混合物によって構成される移動相と接触させます。残りの溶媒量をTLCチャンバーの底に置きます.
手記：TLCチャンバーの底部は、移動相の少なくとも1 cmで覆われている必要があります。本実験では、TLCの開発にさまざまな移動相を使用しました。それらは、85 mLのn-ヘキサンと15 mLのジエチルエーテルで構成されていました。ジクロロメタン100mL;クロロホルム90mL、メタノール10mL、水1mL。クロロホルム30mL、メタノール8mL、水1mL。60 mLのクロロホルム、35 mLのメタノール、および8 mLの水。95 mL クロロホルムと 5 mL のメタノール。90 mLの石油エーテル(60-80 °C)と10 mLのジエチルエーテル
手記：二次元TLCでは、n-ヘキサン:アセトン(95:5)を第1方向に3回使用し、トルエン:アセトン(97:3)を第2方向に1回現像してミコール酸組成を分析します。PIMを解析するには、最初の方向にクロロホルム:メタノール:水(60:30:6)を1回使用し、2番目の方向にクロロホルム:酢酸:メタノール:水(40:25:3:6)を使用します。PDIMおよびAGを分析するには、石油エーテル(60-80°C):酢酸エチル(98:2)を第1方向に3回使用し、石油エーテル(60-80°C):アセトン(98:2)を第2方向に1回現像します><。
注意：ジエチルエーテルは潜在的に有毒で危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：ジクロロメタンは潜在的に有毒で危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：石油エーテルは、可燃性で環境に悪影響を及ぼし、非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：酢酸は、可燃性で腐食性の可能性のある物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：酢酸エチルは可燃性で危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：アセトンは可燃性で危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
- TLCチャンバーを閉じて、少なくとも20分間飽和させます。その間、ガラス管内に存在する脂質を0.2〜1mLのクロロホルムに溶解します.
手記：脂質の溶解に使用される量は、サンプルの所望または予想される濃度に応じて変更できます。
- キャピラリーガラス管を使用して各懸濁液10μLをTLCプレートに直接塗布し、サンプルを室温で5分間乾燥させます
手記：サンプルは、プレートの底部に塗布し、両側に1 cmを残します。サンプルは、少なくとも0.5cmの間、互いに分離する必要があります。サンプルをプレートに塗布すると、チューブを窒素ガスで再度蒸発させ、さらに使用するために4°Cで保存することができます。
- プレートを移動相を含む飽和TLCチャンバーに挿入します。移動相をTLC.
に流します。
手記：TLCチャンバーに加えられる動きは、プレート上のランニング溶媒に影響を与え、脂質の移動性に影響を与えます。2次元TLCを行う場合、両方の溶出システムを収容するために2つのTLCチャンバーが必要です。
- 溶媒がプレートの上端から1cmの距離に達したら、プレートをTLCチャンバーから取り外します。シリカが完全に乾くまで、プレートを層流下に置きます.
手記：n-ヘキサンとジエチルエーテル(85:15)を使用してミコール酸組成を分析する場合は、ステップ 4.4 と 4.5 を 2 回繰り返して、TLC プレート上で移動相を 3 回実行します。
- プレートに必要な汚れが付着している様子を浮かべ、必要に応じてプレートを加熱します。
手記：本実験では、15〜20mLの溶液を使用してTLCプレートにスプレーしました:10%モリブダトリン酸水和物をエタノールに溶かし、プレートが明るい黄色になるまで加熱した後、プレートを120°Cで加熱します。エタノールに5%、硫酸中の20%α-ナフトールを溶解し、続いてプレートを120°Cで加熱する。リン酸バンドが現れるまで、または硫酸に1%アントロンが現れるまで、モリブデンブルー試薬(4.2M硫酸中の1.3%酸化モリブデン)
注意：モリブダトリン酸水和物は可燃性で腐食性の物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：エタノールは、可燃性で危険な物質の可能性があります。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意: 1-ナフトールは可燃性で腐食性があり、非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
注意：モリブデンブルースプレー試薬は、腐食性、毒性、および非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護メガネ、ニトリル手袋)を着用して、層流フードで使用する必要があります。
