ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いたバキュロウイルス精製:昆虫細胞上清からバキュロウイルスを単離する技術

要約

出典:Nasimuzzaman, M. et al., 遺伝子治療応用のためのバキュロウイルスの生産と精製。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを使用して昆虫細胞上清からバキュロウイルスを分離する技術を示します。この単離は、カラム内のヘパリンとバキュロウイルスエンベロープ糖タンパク質との間の親和性によって促進されます。

プロトコル

1. クロマトグラフィーシステムの準備

1. クロマトグラフィーシステムを準備するには、サンプルラインとバッファーラインをそれぞれ滅菌水、1 N 水酸化ナトリウム、水、および洗浄バッファー(150 mM 塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0)で 50 mL/分の直線流速で順次すすぎます。
2. ヘパリン 50 μm カラム(10 × 10 cm、カラム容量(CV)7.9 mL)を調製するには、カラムクリーニングバッファー(2 M 塩化ナトリウム含有 5 CV 滅菌 20 mM リン酸ナトリウムバッファー)と 5 CV 洗浄バッファーを 7 mL/分の直線流速で順次分析します。

2. バキュロウイルスベクターの精製

1. クロマトグラフィーシステムを次のようにセットアップします。
   1. サンプルローディングインレットポートを使用して、バキュロウイルス上清をロードします。
   2. 洗浄バッファーをロードするには、バッファーインレットポートA1を使用します。少なくとも500mLの洗浄バッファーを含むボトルを準備し、洗浄バッファーラインをボトルに入れます。.
   3. 溶出バッファー(20 mM リン酸ナトリウムと 1.5 M 塩化ナトリウム、pH 8.0)をロードするには、バッファーインレットポート A2 を使用します。溶出バッファーを500mL以上入れたボトルを調製し、溶出バッファーラインをボトルに入れます。
   4. フラクションコレクターに50 mLコニカルチューブを数本挿入し、カラムパススルーバキュロウイルス上清、洗浄バッファー、溶出バキュロウイルスを回収します。
2. 7.0 mL/分の直線流速で、5 つの 7.9 mL カラム容量(CV)の洗浄バッファー(40 mL)とヘパリンカラムを平衡化します。
3. クロマトグラフィーシステムのサンプルポンプ(入口サンプルポート)を使用して、2.0 mL/minの直線流速で250 mLのバキュロウイルス上清をヘパリンカラムにロードします。
4. 10 CV(80 mL)の洗浄バッファーをヘパリンカラムに2.0 mL/minの直線流速で流し込み、紫外線(UV)吸光度曲線(280 nm)がベースラインに戻り安定するまで
分析します。
5. 7.9 mL ヘパリンカラムからバキュロウイルス粒子を溶出し、5 CV(40 mL)の溶出バッファーを 4.0 mL/分の直線流速で溶出します。バキュロウイルス粒子がヘパリンカラムから解離すると、クロマトグラム上のタンパク質の急激な溶出ピークが
観察されます。
6. 溶出後、溶出したバキュロウイルス上清を20 mMリン酸ナトリウム緩衝液で水で10倍に希釈し、その後の遠心分離で浸透圧ショックによるバキュロウイルス粒子の不活性化を防ぎます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクタアバント150	GEヘルスケア	28976337	クロマトグラフィーシステム
POROS Heparin 50 μm カラム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4333414	ヘパリンカラム
ウォッシュバッファー	社内	カタログ以外のアイテム	150 mmol/Lの塩化ナトリウムを含む20 mmol/Lのリン酸緩衝液
溶出バッファー	社内	カタログ以外のアイテム	1.5 mol/l の塩化ナトリウムを含む 20 mmol/l リン酸緩衝液
50mlコニカルチューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14-959-49A	バキュロウイルス上清の収集に
カラムクリーニングバッファー	社内	カタログ以外のアイテム	2.0 mol/l塩化ナトリウムを含む20 mmol/lリン酸緩衝液
滅菌水	社内	カタログ以外のアイテム	Akta Avantのクリーニング用
水酸化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	1.09137	Akta Avantのクリーニング用