陽イオン交換クロマトグラフィー:正味表面電荷に基づいて昆虫細胞溶解物から標的組換えタンパク質を単離する技術

要約

出典:Agamasu, C. et al.完全に処理された組換えKRAS4b:ファルネシル化およびメチル化タンパク質の単離と特性評価。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、昆虫細胞タンパク質ライセートから組換えタンパク質を単離する陽イオン交換クロマトグラフィー技術を示しています。

プロトコル

1. タンパク質の精製

1. 表 1 に示すように、バッファー A から H を準備します。

の の 名 名 名 名 名 名 名 名 名

緩衝液	バッファリング剤(すべて20 mM)	pH	NaCl (mM)	イミダゾール(mM)	MgCl2	TCEP
ある	ヘープス	7.3	300	-	5	1
イ	ヘープス	7.3	300	35	5	1
ハ	ヘープス	7.3	300	500	5	1
ダ	MESの	6.0	200	-	5	1
E	MESの	6.0	-	-	5	1
エフ	MESの	6.0	100	-	5	1
Gさん	MESの	6.0	1000	-	5	1
H	ヘープス	7.3	300	-	1	1

2. 精製材料を準備します(材料の表を参照):EDTAまたは他のキレート剤を含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラム、陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)カラム、0.45 μmシリンジフィルター、2 Mイミダゾール(pH = 7.5)、100,000 x gの超遠心分離機、4,000 x gの高速卓上遠心分離機;遠心フィルターユニット(10 KDa NMWL);280nmで読み取ることができる分光光度計。His6-タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼ;また、2つの緩衝液の混合、カラムへの溶液の適用、カラムからのグラジエント溶出の作成、およびカラムからのフラクションの収集が可能なクロマトグラフィー装置。
3. 昆虫細胞溶解物を透析から取り出し、4,000 x gで10分間遠心分離して沈殿物を除去します。この時点で透析され、清澄化された最終的なサンプルは、まだ曇っていることがよくありますが、後続のCEXカラムにさらに処理を行わずに適用できます。
4. 20 mL の陽イオン交換カラム(材料表を参照)を調製するには、バッファー G を 3 CV で洗浄し、次にバッファー F.
   を 3 CV で洗浄します。 手記：他の樹脂については綿密に評価していませんが、SP セファロース ハイパフォーマンス樹脂以外の樹脂では分解能が悪いという
報告が何人か出ています。
5. 20 mLのバッファーEを加えて、透析したサンプル20 mLを最終NaCl濃度100 mMに希釈し、希釈したサンプルを陽イオン交換カラムに塗布します。
6. 上記のように調製した新たに希釈したサンプルをロードチューブに追加し、前の希釈がロードの終わりに近づいたら、カラムをロードし続けます。
   手記：サンプル全体を一度に100 mM NaClに希釈すると、沈殿により標的タンパク質が大幅に失われました。
7. カラムをバッファーFでベースラインAbs280まで洗浄します。これには通常3CVが必要です。タンパク質は、バッファーFから65%バッファーGへの400 mL(20 CV)グラジエント中にカラムから溶出され、6 mLのフラクションで収集されます(図1B)。
8. グラジエントが完了したら、カラムをさらに1.5 CV(65% Buffer G)で洗浄し続けます。

結果

図1:精製プロセスのSDS-PAGEゲル。(A)ライセートからのIMACキャプチャ。FNTA/B は ~48 kDa で移動するダークバンドで、His6-MBP-tev-KRAS4b は ~67 kDa で移動するダークバンドです。M =タンパク質分子量ラダー;T =総タンパク質;L = 清澄化されたライセート/カラム負荷量;F = カラムフロースルー。フラクションは、イミダゾール濃度勾配の増加とともに溶出されます。(B)1 〜 5 とラベル付けされた CEX 画分は、溶出ピークのピーク画分に対応しています。(C)TEV消化と2回目のIMAC。C = CEXステップのTEV前切断からのプール。L = TEV 切断後のサンプルのロード。対象種にはラベルが付けられています。(D)最終KRAS4b-FMe...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.8 mL セーフロックチューブ、ナチュラル	エッペンドルフ	22363204
11 mm Cl SS インターロックインサートオートサンプラーバイアル	サーモサイエンティフィック	30211SS-1232
5427R遠心分離機	エッペンドール
アセトニトリル、HPLCグレード	フィッシャーケミカル	A998-1 1L
陽イオン交換クロマトグラフィー(CEX)カラム	GEヘルスケアライフサイエンス	29018183	HiPrep SPセファロースハイパフォーマンス
Exactive Plus EMR質量分析計	サーモサイエンティフィック
ギルソンバイアル7x14mmチューブ	GEヘルスケア	BR-1002-12
高速/ベンチトップ遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	05-112-114D	最大4,000 xgの能力
His6-タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼ	アドジーン	92414	Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Proteaseに従って精製。In:Burgess Brown N.(編)大腸菌における異種遺伝子発現。分子生物学の方法、vol 1586。Humana Press、ニューヨーク、ニューヨーク
EDTAまたは他のキレート剤を含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル	ミリポアシグマ	P8849
酢酸アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	09689-250グラム
アルゴンガス	エアガス	アラップ
蟻酸	シグマ・アルドリッチ	F0507-500MI	試薬グレード以上を使用
NGCクロマトグラフィーシステム	バイオラッド	78880002	NGC QuestTM 100 クロマトグラフィーシステム
ホルダー付き脂質押出機セット	AVANTI POLAR脂質	610023
液体窒素	エアガス	NI-デュワー
Ultra-15遠心フィルターユニット、10K NMWL	ミリポアシグマ	UFC901008	PESメンブレン
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 遠心分離機用フィルター	アミコン	UFC501024
超遠心分離機	ベックマン・コールター	オプティマ - L80K	100,000 xgの能力
荒れ	シグマ	C3023