サイズ排除クロマトグラフィーに基づく細菌細胞外小胞の分離:グラム陰性細菌外膜小胞の不均一集団をそのサイズに基づいて分離する技術

要約

出典:Collins, S. M., et al., Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity.J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、外膜小胞または細菌由来のOMVの不均一な集団を分離する技術(サイズ排除クロマトグラフィー)を実演します。これらの小胞はナノサイズの球状構造であり、サイズ排除クロマトグラフィーによってそのサイズに基づいて大小の亜集団に分離されます。

プロトコル

1. バッファーの準備

1. ELISA洗浄バッファーを調製するには、3.94 gのトリス塩基、8.77 gのNaCl、および1 gのウシ血清アルブミン(BSA)を1 Lの脱イオン(DI)水に加えます。500 μL ポリソルベート-20 を添加します。HClまたはNaOHを使用してpHを7.2に調整します。
2. ブロッキングバッファーを調製するには、3.94 gのトリスベース、8.77 gのNaCl、および10 gのBSAを添加します。500 μL のポリソルベート-20 を 1 L の DI 水に加えます。HClまたはNaOHを使用してpHを7.2に調整します。
3. 溶出バッファー(PBS)を調製するには、8.01 g NaCl、2.7 g KCl、1.42 g Na₂HPO₄、および 0.24 g KH₂PO₄ から 1 L の DI 水を加えます。HClまたはNaOHを使用してpHを7.4に調整します.
   手記：このバッファーの10倍溶液を調製し、必要に応じて脱イオン水で希釈することができます。

2. OMVサンプルの準備

1. A. actinomycetemcomitans細胞を後期指数関数的段階(600 nmでの光学密度0.7)まで増殖させます。細胞を10,000 x g、4°Cで2回遠心分離し、10分間ペレット化します。0.45 μmフィルターで上清をろ過します。
2. 無菌の上清を50 kDa分子量カットオフフィルターを使用して濃縮します。濃縮溶液を105,000 x g、4°Cで30分間超遠心分離します。
3. ペレットをPBSに再懸濁し、再度超遠心分離します(105,000 x g、4°Cで30分間)。ペレットを2mLのPBSに再懸濁します。

3. S-1000カラムのパッキング

1. ゲルろ過媒体のストックボトルをガラス攪拌棒と混合し、カラムを満たすのに必要な容量に約50%の過剰分(約135mL)を加えた量をガラスボトルに注ぎます。これらのビーズが落ち着くまで放置し、余分な液体をデカントします。ビーズを溶出バッファーに再懸濁し、最終溶液が約70%(容量比)ゲル、30%バッファーとなるようにします。真空下で溶液を脱気します。
2. リングスタンドを使用してガラスカラムを垂直に取り付け、溶出バッファーを充填してカラムの壁を濡らします。カラムに約1cmのバッファーが残るまで、バッファーを排出します。
3. 気泡を作らないように、ビーズを慎重にカラムにピペットで入れ、カラムを上部まで満たします。このプロセス全体で、余分なバッファーをドレインし続けます。列の上部にビーズを追加する前に、ビーズが完全に沈殿しないように注意してください。カラムは、カラムリザーバーの底から約2cmの高さまで充填する必要があります。

4. サンプルのロードとフラクションの収集

1. 真空下で溶出バッファーを脱気します。カラム容量2本(180 mL)の溶出バッファーでカラムを洗浄します。
2. 残りのバッファーが列に完全に入るまで待ちます。バッファーがゲル層の上部に到達したら、OMV(脂質濃度約100〜200 nmol / L)を含む2 mLのサンプルを、カラム上部のビーズを乱さないように注意しながら、ビーズの表面に慎重にピペットで移します。サンプルがゲルに完全に入るのを待ちます、つまり、ゲル層の上に液体が残っていないときです。
3. ゲルカラムの上に溶出バッファーを慎重にゆっくりと加えます。ゲルの最上層を乱すとサンプルが希釈されるため、邪魔しないでください。
4. カラムの下に50 mLチューブを1本置き、カラムを開きます。溶離液の最初の 20 mL を回収します。カラムの上部に溶出バッファーを、必要に応じて慎重に追加し、カラムが乾燥しないようにします。
5. 一連の 1.5 mL チューブをカラムの下に置きます。カラムを開始し、各チューブに一連の 1 mL サンプルを回収します。サンプルを採取しながら、必要に応じてカラムの上部に溶出バッファーを引き続き追加します。96個のフラクションが収集されるまで繰り返します。列を停止します。
   手記： サンプルは、長期保存の場合は-20°C、短期保存の場合は4°Cで保存し、さらに分析するまで保存する必要があります。
6. カラムを洗浄するには、1つのカラム容量(90 mL)の0.1 M NaOHをカラムに通します。2カラム容量(180 mL)の溶出バッファーをカラムに通します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アミコン50kDaフィルター	ミリポアシグマ	UFC905024
エフエム4-64	サーモサイエンティフィック	T13320	1.5 x 50センチメートル
ガラスエコノコラム	バイオラッド	7371552
塩化カリウム(KCl)	アムレスコ (VWR)	0395〜500グラム
リン酸カリウム一塩基性無水物(KH2PO4)	アムレスコ (VWR)	0781-500グラム
セファクリル S-1000 スーパーファイン	GEヘルスケア	17-0476-01
塩化ナトリウム(NaCl)	フィッシャーケミカル	S271-3
リン酸二塩基性無水ナトリウム(Na2HPO4)	アムレスコ (VWR)	0404-500グラム
トリスベース	VWRの	0497-1KG