RNA含有エキソソームの単離と解析

サマリー

本論文では、エクソソームの単離、精製および検出のための方法、ならびにそれらの分子量の分析のためのテクニックを示しています。これらのメソッドは、細胞培養液や体液の両方からエキソソーム分離のための適応であり、分子量の分析を越えても機能的研究に役立ちます。

要約

エキソソーム研究の分野は近年急速に出版物の劇的な増加と、拡大しています。エンドサイトーシスの起源のこれらの小胞は（30〜100 nmの）最初の赤血球¹に成熟しながら、網状赤血球は、トランスフェリン受容体を根絶するための手段として機能するように提案し、後で名前エクソソームであった。エキソソームは、多胞体（MVBs）の製造、後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、原形質膜² MVBsの融合により、環境中に放出されています。エクソソームの最初の発見以来、セルの広い範囲は、これらの小胞を放出することが示されている。エキソソームは、プラズマ、鼻洗浄液、唾液や母乳^3月6日を含むいくつかの生物学的流体、検出されている。さらに、それはエクソソームの内容と機能は元の細胞とそれらが生成される条件に依存することが実証されている。様々な機能が悪魔となっているT細胞増殖¹⁴の刺激、制御性T細胞にそのようなアレルゲン^7,8に対する寛容の誘導など、エクソソーム、、マウス⁹の確立された腫瘍の撲滅、ナチュラルキラー細胞^10-12の抑制と活性化、分化の促進¹³のtratedとT細胞のアポトーシス¹⁵の誘導。 2007年に我々は、肥満細胞から放出さエクソソームは、メッセンジャーRNA（mRNA）とマイクロRNA（miRNAを）含んでいる、とRNAが1つのセルからエクソソームを経由して別のに往復することができるということを示した。レシピエントの細胞では、エクソソームで往復mRNAを転送RNA ¹⁶の調節機能を示唆し、タンパク質に翻訳されることが示された。さらに、我々はまた、酸化ストレス下で増殖した細胞から派生したエクソソームは、レシピエント細胞にさらなるストレスに対する耐性を誘導するため、exosomalシャトルRNA ¹⁷の生物学的機能を提案できることが示されている。細胞培養培地や生体液のCO小胞の混合物をntainとフラグメントを流した。エクソソームのための高品質の単離法は、特性評価およびエクソソームとそのコンテンツの識別に続いて、したがって、他の小胞と粒子からエクソソームを区別するために不可欠です。ここで、我々は、細胞培養の培地や体液の両方からエクソソームの単離のための方法を提示する。この分離法はエクソソームはペレット化されている最後の超遠心分離のステップに続いて、繰り返しの遠心分離やろ過のステップに基づいています。エクソソームを特定し、exosomal形態及び蛋白質含量を特徴づける重要なメソッドは、電子顕微鏡、フローサイトメトリーとウェスタンブロット法を含めて、強調表示されます。トータルexosomal RNAの精製はスピンカラムクロマトグラフィーに基づいており、exosomal RNAの収量とサイズ分布は、バイオアナライザを用いて分析される。

プロトコル

1。エキソソーム分離

1. エキソソーム無血清培地で細胞を成長させる。従って、細胞培養の培地に追加された血清を使用して° Cの前で4晩にわたって120 000 × gで超遠心分離によりエクソソーム枯渇してください。
2. コニカルチューブに細胞懸濁液を移す。
3. 10分、4、300 xgで遠心°細胞をペレットにC。
4. チューブを遠心していない場合は完全に一杯に追加PBSに上清を移す。
5. 4℃20分間に16 500 × gでサンプルを遠心° Cは、さらに、細胞と細胞破片を除去する。
6. 200nmより大きな粒子を除去するフィルター0.2μmの上清をフィルタします。
7. 新しい遠心チューブにフィルタ処理された上清を移し、4℃で70分間120 000 xgで超遠心前にチューブをシール° Cをペレットエクソソームする。
8. 上清を捨てる。
9. 最大エキソソーム検索のために、豊かにエキソソームを再懸濁します。適切なバッファの少量（〜3 × 50μlの）の繰り返しEDペレット。このバッファは、エキソソーム単離後に計画のダウンストリームの実験によります。例えば、溶解用緩衝液は蛋白質とRNAの単離のために使用され、PBSは、電子顕微鏡やフローサイトメトリー用と機能研究の培地が推奨されるために使用されます。

注;エクソソームはまた、細胞培養培地と同じ手順を使用して、そのようなプラズマのようなさまざまな体液から単離することができる。粘性流体の場合には、事前の遠心分離や濾過工程にPBSでサンプルを希釈する必要があるかもしれません。上記の点5の遠心速度に関連して、それが29 500 XGに増やすことができ、ポイント7の超遠心分離を90分間¹⁸に拡張することができます。

サンプルは、さらに精製する必要がある場合エキソソームペレットは、ショ糖勾配に上場することができるとエクソソームは、分数のrepreseで主に発見される1.13〜1.19グラム/ mlの²の密度をnting。

2。電子顕微鏡によるエキソソーム同定

1. さらに夾雑タンパク質を除去するために、4℃で70分間120 000 XG℃の再ペレットにエクソソームにPBSおよび超遠心機でエキソソーム濃縮ペレットを再懸濁します。
2. タンパク質の単離および総タンパク質測定用サンプルの小アリコートを取る。サンプルの小さな部分のみが蛋白質の測定に溶解し、使用されていることを確認し、氷上で別または-80℃でさらなる実験のためにPBSで解決そのままエクソソームを、、してください。
3. パラフィルム上にドロップ、PBSに再懸濁さ無傷エクソソームのexosomalタンパク質の約10μgを、置きます。その後、ピンセットで、軽く30〜60分間、各ドロップの上にformvar炭素コーティングされたニッケルグリッドを配置します。グリッドがエクソソームを含むドロップが直面しているコーティングの側に配置されていることを保証。
4. t上でPBSを3滴、それぞれを30μl、場所彼パラフィルムとは、順次PBSの滴の上にグリッドを配置することで、グリッドを洗う、との間で​​吸収紙を使用してください。塗布面積で接触することなく、グリッドの側面に密接にそれを保持することによって静かにちょうど吸収する紙を使用してください。
5. 預金によるパラフィルム上に2％のパラホルムアルデヒドのドロップを、サンプルを修正し、10分間ドロップの上にグリッドを配置します。
6. 適切な抗体で免疫染色する前に、ポイント4の洗浄ステップを繰り返します。一般的に使用される抗体は、抗CD63及び抗MHCクラスIIです。電子顕微鏡は、エクソソームはもっぱらサイズと形態に基づいて識別することができるように免疫染色することなく行うことができます。しかし、我々は大きさ、形態およびより多くの決定的な検証のための膜タンパク質の存在を評価することをお勧めします。
7. 選択した一次抗体30μlのドロップにグリッドを移し、40分間インキュベートする。ポイント4を繰り返して洗浄す​​るが、PBにアルブミン0.1％ウシ血清を使用してください代わりにPBS単独でのS。
8. ポイント7を繰り返しますが、10 nmの金標識二次抗体やPBSのみで洗浄した。
9. パラフィルムに2.5％グルタルアルデヒドのドロップを追加することによってサンプルをポスト修正し、10分間ドロップの上にグリッドをインキュベートする。ポイント4の洗浄を繰り返しますが、脱イオン水五滴の代わりにPBSで3滴を使用してください。
10. パラフィルムに2％酢酸ウラニルのドロップを追加することにより、試料を対比し、15分間ドロップの上にグリッドをインキュベートする。
11. パラフィルムの0.13％メチルセルロース及び0.4％酢酸ウラニルのドロップを追加することによってサンプルを埋め込むと、10分のドロップの上にグリッドをインキュベートする。
12. コー​​ティングされた面を上にして紙の上にグリッドを配置する前に、ゆっくりと吸収紙を使用して余分な液体を取り出し、5分間空気が乾燥してみましょう。
13. 電子顕微鏡による調剤を調べたり、今後の作業のためのグリッドボックスにグリッドを格納する。

3。フローサイトメトリーによるエキソソーム特性評価

エクソソームは、現在のフローサイトメトリー装置によって検出されるには余りにも小さいので、それは第一抗体コーティングビーズ（ 図1）にエクソソームをバインドする必要があります。これらのビーズは、どちらかの既製の製品として購入または任意の抗体を用いて実験室で行うことができます。 exosomal細胞起源に応じて、異なる抗体は磁気またはラテックスの文字のいずれかになります。ビーズに結合させることができる。我々は現在、この分析のために抗MHCクラスIIまたは抗- CD63をコーティングしたビーズを使用してください。

1. "手作り"抗体被覆ビーズの使用のために、我々は、抗CD63抗体でコーティングさ4μmのラテックスビーズを使用してください。二回、100μlのMES緩衝液に25μlの4μmのラテックスビーズ（30 × 10 ⁶ビーズ）、15〜20分間3 000 XGを洗い、100μlのMES緩衝液中でペレットを再溶解。 MESバッファーの同じ体積で12.5μgの抗体の等量を含む抗体の混合物を準備します。追加抗体の混合物と室温で一晩撹拌下でインキュベートビーズ。 PBSで抗体被覆ビーズを3回洗浄（20分間3 000 XG）と（300 000ビーズ/μlの最終濃度）ストレージバッファー100μlでペレットを溶解する。
2. 各サンプル（各抗体）の場合は、〜あたりexosomalタンパク質30μgの（PBSで解決無傷エクソソームの）100 000抗体被覆ビーズの最小値に等しい体積を続行します。
3. 4℃一晩、300μlのPBSの合計量で、エクソソームとビーズをインキュベート° C穏やかな動きの下で。
4. 30分、200 mMグリシンとインキュベートの300μlを添加することによりブロック。
5. 回洗浄バッファーでエキソソーム-ビーズ複合体（PBSで1-3％血清）、10分は600 XGを洗ってください。
6. 4時50μlのIgG抗体とエキソソーム-ビーズ複合体℃をインキュベート手順5で説明したように洗浄バッファーで二度エキソソーム-ビーズ複合体を洗ってください。
7. 90μlの洗浄バッファーと10μlを添加します選択肢の抗体（理想的に抗CD9、抗CD63または抗CD81）穏やかな動きの下で40分間、エキソソーム-ビーズ複合体とインキュベートする。エキソソーム-ビーズ複合体を手順5で説明したように洗浄バッファーで2回洗浄する。
8. 300μlの洗浄バッファーを追加し、フローサイトメトリーを使用してデータを取得する。

上述のようにプロトコルまたは磁気ビーズで説明したように、さまざまなビーズは、ラテックスビーズとして、使用することができます。磁気ビーズが代わりに使用されている場合、プロトコルは若干異なっていることに、注意してください。ブロッキングステップ（ポイント4）要求されないし、洗浄の代わりに遠心分離の磁気スタンドにチューブを配置することによって行われます。

"手作り"抗体被覆ビーズに使用されるストレージのバッファは、0.1％グリシン、7.2のpHで、PBSでazid 0.1％ナトリウムが含まれています。

重要なのは、任意のを避けるために、フローサイトメトリーの洗浄バッファー（PBSで1-3％血清）、血清枯渇エキソソームを使用してください分析を汚染血清エクソソーム。

（注）は、抗体結合ビーズを使用してエキソソーム特性評価を行う際に、それは唯一の単離および特徴付けされ使用される抗体、のための特定の特定の亜集団、であることを認識することが重要です。

4。ウエスタンブロットによるエキソソーム検出

ウエスタンブロットは、十分に確立された手法であり、我々は、方法自体に関する詳細に入るが、ウェスタンブロットおよび使用される異なる抗体を前に適当な蛋白質の分離の重要性に焦点を当てることはありません。

1. 渦混合が続く、任意のタンパク質の溶解緩衝液中でエキソソームペレットを溶解し、徹底的にピペッティング。さらにエクソソームを溶解するために、水浴3にサンプルを超音波で分解する間に渦混合によるx 5分。最後に室温で5分間、13 000 XGのサンプルを遠心し、新しいエッペンドルフチュー​​ブに上清を移す。
2. Measu選択の方法により総タンパク質を再し、ウェルあたりのタンパク質の20〜50μgをロードする。
3. ゲル電気泳動とエレクトロブロッティングによりタンパク質を分離して譲渡する。
4. エクソソームに富んだタンパク質に対する免疫染色を行う前に、膜をブロックして洗う。
5. 化学発光、デジタルイメージングシステムと解析ソフトウェアにより、特定のタンパク質を検出します。

すべてのさまざまな細胞起源からのエキソソーム特異的なマーカー、エクソソームに富む蛋白質は、存在しないため、一般的にエキソソーム検出に使用されています。これらは、そのようなテトラスパニン（例えばCD9、CD63およびCD81）、細胞骨格関連タンパク質（例えば、エズリン）と多胞体生合成（例えばTsg101とアリックス）に関与するタンパク質などのタンパク質です。また、一般的にエクソソームで検出された他のタンパク質がFlotillinは、Hsc70と異なるRabタンパク質などあくまでしかし、そのようなA33（腸上皮細胞）のようなエクソソームに見られる細胞特異的タンパク質は、CD3もあります（T細胞）とMHCクラスII（抗原提示細胞）。従って、エクソソームは検出のためのマーカーから解放されているかの細胞型からによって異なる場合があります。

セルの他の区画も小胞を作ることができるように、それはさらに、小胞体（例えばカルネキシンとGRP78）とゴルジ体（例えば、GM130）としてこれらのコンパートメントからのタンパク質の存在を決定することをお勧めします。従って、これらのタンパク質の欠如は、研究試料中の他の区画の小胞のない、またはほとんど汚染がないことを示します。

5。 exosomal RNAとRNA解析の分離

1. 選択肢のRNA Lysis Buffer中でエキソソームペレットを溶解し、RNA抽出を行う。別のRNA分離キットは、下流の実験に応じて使用できますが、列ベースのメ​​ソッドは、RNAの広いスペクトルとサンプルを提供することができます。我々は現在、ExiqonでmiRCURY RNAアイソレーションキットを使用しているが、他のキットは、SCに応じて適切な場合があります手でientific質問。
2. RNAの分離を実行する際には、RNaseフリーの環境で動作することが重要です。したがって、核酸とヌクレアーゼフリーピペットチップを使用し、汚染物質とのRNaseのないベンチと機器の両方を拭いてください。
3. RNAの単離のために、miRCURY RNAアイソレーションキットを使用することにより、溶解液を350μlにエキソソームペレットを溶解し、15秒間ボルテックスミキシングを行います。
4. 95％エタノールと10秒間ボルテックスミキシングを200μlを追加。
5. コレクションチューブにカラムを配置し、列に溶解したエクソソームを転送すると14 000 x gで1分間遠心分離
6. 14,000 x gで1分間exosomal RNAと遠心分離機を含むカラムにWash Solutionを400μlを加えることによって3回洗浄
7. カラムが乾燥していることを確認し、RNaseフリーのエッペンドルフチュー​​ブに乾燥した列を配置するXGの14 000℃で2分間カラムを遠心する。
8. 2のカラムと遠心に50μlの溶出バッファーを追加します。 200 xgで数分は、14 000 x gで1分間続く
9. 単離されたRNAを続行または-80に保管℃に

抽出した全exosomal RNAの検出と分析のために、RNA 6000ナノまたはRNA 6000ピコキットでAgilent 2100バイオアナライザを使用してください。分析は、exosomal RNAの収量とサイズ分布を示しています。

6。代表的な結果

エキソソームは、利用可能なフローサイトメトリー法によって検出するには小さすぎるため、解析される前に抗体でコーティングされたビーズ（ 図1）に添付されています。エキソソーム-ビーズ複合体が集約できるようにフローサイトメトリーの散布図ではシングル、ダブル、トリプルビーズの異なる集団（ 図2A）を含めることができます。矢印は、さらに分析される単一のビーズを示します。そのアイソタイプコントロールと比較してCD63の正の単一ビーズエキソソーム人口は、 図2Bに示されています。

e_content">エクソソームの小さなサイズのため、彼らは唯一の電子顕微鏡ではなく、光学顕微鏡で直接可視化できる。エクソソームの典型的な形態的特徴は、丸い形をして30〜100 nmのサイズの膜小胞である。 図3では 、電子顕微鏡写真は金標識CD63に対する抗体（矢印で示される）と非免疫染色エクソソーム（B）と（）免疫染色エクソソームを示しています。

孤立した小胞が実際にエクソソームであると判断し、さらにexosomalタンパク質を特徴付けるために、ウエスタンブロット法を用いて、一般的に使用されています。 図4は、カルネキシン、小胞体のマーカーが存在しないことを示しています。これは、小胞体から小胞の混入の少ないことを示します。さらに、 図4は、一般的にエクソソームに富んだテトラスパニンであるエクソソームのCD81の存在を示しています。

細胞のRNAは、主に含まれていますバイオアナライザの分析（ 図5A）の18Sおよび28S rRNAのサブユニットの2つの顕著なピークとして見られるのリボソームRNA（rRNA）、。エクソソーム二つrRNAのピーク（18Sと28S）を欠いていると、例えばmRNAとmiRNA（ 図5B）などの短いRNAに富むしかし、exosomal RNAは、自分のプロファイルが異なります。

図1。フローサイトメトリーで分析するときにエクソソーム（30〜100 nm）の小さなサイズのため、彼らは、ノイズや背景から区別することはできません。したがって、それは、レーザーによって可視化できるエクソソームが解析される前に、抗体被覆ビーズ、それらを添付する必要があります。

図2。エキソソーム-ビーズ複合体互いにフォーム、ダブル、トリプルビーズ（）を使用して集約することができます。矢印は、単一のビーズ-エキソを実証しているゲートとさらなる分析のために使用されているいくつかの人口。この人口は、直接エクソソームの膜分子の存在を決定するアイソタイプコントロール（塗りつぶされた灰色のピーク）と比較されます。 CD63ポジティブエクソソームは、（黒オープンピーク）の図Bに示す。

図3。典型的な形態とサイズ（40〜80 nm）の（AとB）とエクソソームの電子顕微鏡写真。図中の矢印は、このエキソソームは、その膜表面上にCD63を持っていることを検証する、二次抗体の黄金の粒子を示している。

図4。小胞体のタンパク質のカルネキシンの欠如が、一般的にエクソソーム、テトラスパニンCD81に富むタンパク質の存在を示すウエスタンブロットの結果。

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図5。細胞（）とエクソソーム（B）でのプレゼンスのRNAを示すバイオアナライザの結果。矢印は細胞内に存在する18Sと28S rRNAのサブユニットを示しています。 exosomal RNA男らしいが、小さなRNAが含まれているとしても、またはほとんどのrRNAはエクソソームで識別されていません。

ディスカッション

分子コンテンツおよび/またはエクソソームの機能を研究するとき、それは適切な収率と汚染の可能な限り低い学位を提供する高品質の単離法を使用することが重要です。このホワイトペーパーで説明されている方法論は、エクソソームを分離し、それらのRNA含有量と生物学的機能を研究するための十分に確立されたアプローチです。さらに、孤立エクソソームの特性評価の重要性は、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットを含むさまざまな方法の組み合わせによって、強調表示されます。

エクソソームを分離する場合、最初の遠心分離工程（300 × gでは）細胞懸濁液または調査生物学的流体中に存在する可能性のある細胞をペレット化するために使用されます。ペレット死細胞、大きい破片、アポトーシス小体や他の細胞小器官に十分に強いものに16 500 × gでのニーズの第二遠心分離。この遠心分離の後、一部のプロトコルは、ナノろ過工程が、いくつかINVが含まれていますestigatorsは、このステップを除外している。しかし、我々は200nmよりも大きいの根絶の断片と小胞の重要性を強調するため、強く、濾過工程を含めることをお勧めします。より厳格な分離が必要な場合は、100nmのフィルターが使用されますが、高粘性流体が使用されている場合、これらのフィルタを簡単にブロックになることができるとexosomal材料が失われることに注意することができます。また、100nmのろ過は、エクソソームの形態に影響を与える可能性がありますし、さらにエクソソームが大規模にある場合、それらが失われる可能性があります。従って、200nmのフィルターは、エキソソーム分離に適しているようです。濾過後、120,000 xgで必須の超遠心分離は、ペレットエクソソームするために使用されます。エクソソームは、さらに抗体被覆ビーズに結合し、洗浄し、PBSで洗浄し、または汚染のタンパク質を除去するために、ショ糖勾配上に配置することができます。しかし、これはスタートサンプル量が小さいと/またはRNA含有量Oの場合は特に、我々は必要ではないと主張することは非常にリソースがかかる可能性がありますFエクソソームは、余分な手順は、実質的にさらに材料を減らすので、低いです。しかし、再び、隔離された小胞の性質は、特定のタンパク質の存在下および非存在によって証明されるべきである。

日付に、エクソソームには絶対的にユニークなタンパク質マーカーは、サンプルがエクソソーム、それ以外のものが含まれていることを確認するために同定されていない。その結果、方法の組み合わせは、電子顕微鏡によるエクソソームの大きさと形態の決定を含むエクソソームを、特徴づけるために必要とされています。このメソッドはそのような微粒子、アポトーシス小体や細胞の破片などの大規模な小胞、と例えば、サンプルの汚染のレベルの概要を提供することができるとしても、サンプルの純度は、電子顕微鏡によって測定することができる。また、エクソソームのタンパク質含有量（例えばCD63を結合した​​膜の両方の分析でフローサイトメトリーとウェスタンブロット法、及びこれら二つのメソッドの結果の組み合わせによって決定することができるとCD81）とエクソソームの内部化タンパク質（例えばTsg101とアリックス）。このようなCD63、Tsg101とアリックス、そしてそのような小胞体蛋白質カルネキシンのようなタンパク質の欠如など、エクソソーム、に富むタンパク質の検出は、エキソソーム濃縮ペレットが実際にエクソソームと細胞の他の区画からではない汚染する小胞であることを示しています。

エクソソームで検出されるRNAのプロファイルは、無傷の細胞で検出されたRNAのそれと根本的に異なっている。従って、バイオアナライザでまたはゲルベースの​​RNAの解析手法で分析したexosomal RNAは、細胞のRNAの解析において顕著な18Sと28S rRNAのサブユニット、の2つのピークを欠いている。したがって、サンプルのrRNAのいずれかのかなりの量の検出は、分離の方法が改善し、品質を保証する必要があることをこのように抽出したtotal RNAは単独でexosomal起源ではないことを示す、と主張する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
エキソソーム分離
オプティマL - 90K超遠心機	ベックマンコールター	65670
クイックシールの超遠心管	ベックマンコールター		別のチューブを使用するローターに応じて必要とされる。 Ti70（342414）、Ti45（345776）
クイックシールコードレスチューブトッパーキット	ベックマンコールター	358312
Filtropurシリンジフィルター、0.20μm	ザルスタット	83.1826.001	VWRインターナショナルからビスコース液体および/または大容量、真空ろ過システム、0.2μmの、のために（514〜0600）の代わりに使用することができます。
電子顕微鏡法
Formvar /カーボンコーティングされたニッケルグリッド	テッドペラ株式会社	1GN200
マウス抗ヒトCD63	バイオサイエンスBD	556019	最終濃度：0.05μg/μl
アイソタイプコントロール、IgG1κ（MOPC 21）	シグマアルドリッチ	M9269	最終濃度：0.05μg/μl
抗マウスIgG金共役、10nmの	シグマアルドリッチ	G7777	最終濃度：1％
LEO 912ABオメガ電子顕微鏡	カールツァイスNTS		または同等の装置。
フローサイトメトリー
4μmaldehyd /硫酸塩ラテックスビーズ	界面動力学	12から4000
ラテックスビーズのコーティング用抗体			バイオサイエンスBD（556019）からの例の抗CD63用
インテリミキサーRM - 2L	ELMI		または同等の装置。
ヒト血清からのIgG	シグマアルドリッチ	I4506
検出用抗体	バイオサイエンスBD		たとえば、次のようにPE抗CD63（556020）PE抗CD9（555372）PE、抗CD81（555676）アイソタイプコントロール（555749）
BD FACSAria	バイオサイエンスBD
ウエスタンブロット法
Transsonic T 490 DH	ELMA		または同等の装置。
exosomal RNAとRNA解析の分離
miRCURY RNAアイソレーションキット	Exiqon A / S	300110
Agilentの2100バイオアナライザ	アジレントテクノロジー	G2939A