出典:Oller-Salvia, B. 高速生体直交反応による抗体薬物複合体の生成のための非標準アミノ酸の遺伝的コード化。J. Vis. Exp.(2018年)。
このビデオでは、抗体薬物複合体の疎水性相互作用液体クロマトグラフィーベースの特性評価を示しています。ブチルリガンドベースのクロマトグラフィーカラムを使用して、抗体-薬物複合体は、リガンドとの疎水性相互作用によって特徴付けられます。
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方法論記事
ブチル依存性疎水性相互作用液体クロマトグラフィー:疎水性相互作用に基づく抗体-薬物複合体の特性評価技術
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. 抗体の作製と特性評価
- 抗体を発現させる
- 100 units/mL ペニシリン、100 μg/mL streptomycin、および 250 ng/mL amhotericin B を添加した 50 mL の発現培地を含む 250 mL フラスコで HEK 懸濁細胞のバイアルを解凍します。125 rpm のシェーカーを装備した加湿インキュベーターで、細胞を 8% CO2 で 37 °C に保ちます。トランスフェクションする前に、細胞を0.3-0.5 x 106細胞/mL(2〜3日ごと)に少なくとも2回分割します。
- 密度が2.5 x 106細胞/mLに達したら(分割後2〜3日)、100 mM CypKの新鮮な溶液を調製します。この目的のために、64mgのCypKを秤量し、2.5mLの0.1水酸化ナトリウムを加え、ボルテックス、スピンダウンしてすべての未溶解粒子を回収し、超音波処理します。
- 抗生物質を添加した42.5 mLの発現培地に2.5 mLのCypK(0.1 M NaOH中に100 mM)を加えます。よく混合し、250 μLの0.1 M HClを加え、0.22 μmフィルターを使用して滅菌します。
- 50 μg の HC および LC pKym1 プラスミドを 2.5 mL に希釈し、血清培地を減らします。別のチューブで、135 μLのトランスフェク....
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エクスピ293F | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A14527 (英語) | HEK懸濁液セル |
| Expi293 エクスプレッション メディウム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1435101 | 発現媒体 |
| 抗生物質-抗真菌薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15240062 | ペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシンB |
| 125mLポリカーボネート製三角フラスコ(ベントキャップ付き | コーニング | 431143 | シェイクフラスコ |
| ブランズウィックS41iインキュベーター | エッペンドルフ | S41I230011 | シェーカー付きCO2インキュベーター |
| 水酸化ナトリウム 4 mol/l (4 N) 水溶液中 | VWRの | 191373M 閲覧数 | |
| シクロプロペンリジン | シケム | SC-8017 | この研究では、Elliot et al. 2014 で説明されているように合成されました。 |
| Steriflip-GP、0.22 μm、ポリエーテルスルホン、ガンマ線照射 | メルクミリポア | SCGP00525 | |
| Opti-MEM、低血清培地 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 31985070 | 減量血清培地 |
| ExpiFectamine 293 トランスフェクションキット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A14525 (英語) | トランスフェクション試薬 |
| 5810 R遠心分離機 | エッペンドルフ | 5811000460 | |
| Millex-GPシリンジフィルターユニット、0.22 μm、ポリエーテルスルホン、33 mm、ガンマ線滅菌済み | メルクミリポア | SLGP033RS | |
| プロテインA樹脂 | シノバイオロジカル | 10600-P07E-RN-25 | |
| ポリ分取クロマトグラフィーカラム、50 個入り | バイオ・ラッド | 7311550 | ポリプロピレンクロマトグラフィーカラム |
| エコノコラムファネル | バイオ・ラッド | 7310003 | |
| クエン酸ナトリウム | フルーカ | 71635 | |
| ÄKTA explorer FPLC | GEヘルスケア | ||
| HiTrap HICセレクションキット | GEヘルスケア | 28-4110-07 | HiTrap 1 mL ブチル HP を含む |
| 硫安 | VWRの | 2133.296 | |
| イソプロパノール | ホニーウェル | 34863-2.5L | |
| ジメチルスルホキシド | シグマ・アルドリッチ | D8418-50ミリリットル | |
| テトラジン-vcMMAE | ケムパートナー | - | 合成されたコスチューム |
| テトラジン-5-TAMRA | イエナバイオサイエンス | CLK-017から05 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 ウェル | サーモフィッシャーサイエンティフィック | NP0321BOX | |
| Xcell SureLockミニセル | サーモフィッシャーサイエンティフィック | EI0001 | |
| UltiMate 3000 HPLC | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| Thermo Scientific MAbPac、HIC-20、4.6 x 100 mm、5 μm | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 88553 | |
| ナノアクイティ | 水 | ||
| ヒト血清 | シグマ・アルドリッチ | H4522-20mL | |
| CO2インキュベーター | パナソニック | ||
| モノメチルオーリスタチンE | ケイマンケミカル | 16267 | |
| ナノドロップ 2000 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | マイクロボリューム分光光度計 | |
| インタントブルー | エクスペデオン | ISB1L(アイビー1L) | クマシーベースのステイン |
| チューブ 50 mL、114x28mm、PP | ザルシュテット | 62.547.254 | 円錐管 |
| アミコンウルトラ15遠心フィルターユニット50,000 NMWL | メルク | UFC905024 | 遠心ろ過濃縮器(プロテインAプルダウン後) |
| Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット 50,000 NMWL | メルク | UFC805024 | 遠心ろ過濃縮器(FPLCまたはHPLC精製後) |
| Zeba スピン脱塩カラム、7K MWCO、0.5 mL | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 89882 | サイズ除外スピンカラム |
| チューブPCR 0.2mlフラットキャップ | シスルサイエンティフィック株式会社 | AX-PCR-02-C-CS | PCRチューブ |
