ブチル依存性疎水性相互作用液体クロマトグラフィー:疎水性相互作用に基づく抗体-薬物複合体の特性評価技術

要約

出典:Oller-Salvia, B. 高速生体直交反応による抗体薬物複合体の生成のための非標準アミノ酸の遺伝的コード化。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、抗体薬物複合体の疎水性相互作用液体クロマトグラフィーベースの特性評価を示しています。ブチルリガンドベースのクロマトグラフィーカラムを使用して、抗体-薬物複合体は、リガンドとの疎水性相互作用によって特徴付けられます。

プロトコル

1. 抗体の作製と特性評価

1. 抗体を発現させる
   1. 100 units/mL ペニシリン、100 μg/mL streptomycin、および 250 ng/mL amhotericin B を添加した 50 mL の発現培地を含む 250 mL フラスコで HEK 懸濁細胞のバイアルを解凍します。125 rpm のシェーカーを装備した加湿インキュベーターで、細胞を 8% CO₂ で 37 °C に保ちます。トランスフェクションする前に、細胞を0.3-0.5 x 10⁶細胞/mL(2〜3日ごと)に少なくとも2回分割します。
   2. 密度が2.5 x 10⁶細胞/mLに達したら(分割後2〜3日)、100 mM CypKの新鮮な溶液を調製します。この目的のために、64mgのCypKを秤量し、2.5mLの0.1水酸化ナトリウムを加え、ボルテックス、スピンダウンしてすべての未溶解粒子を回収し、超音波処理します。
   3. 抗生物質を添加した42.5 mLの発現培地に2.5 mLのCypK(0.1 M NaOH中に100 mM)を加えます。よく混合し、250 μLの0.1 M HClを加え、0.22 μmフィルターを使用して滅菌します。
   4. 50 μg の HC および LC pKym1 プラスミドを 2.5 mL に希釈し、血清培地を減らします。別のチューブで、135 μLのトランスフェクション試薬を減血清培地で2.5 mLに希釈します。
   5. 溶液を調製してから5分後に、プラスミドとトランスフェクション試薬溶液を混合し、20分間インキュベートして、DNAとトランスフェクション試薬との間に複合体が形成されます。
   6. その間に、1億2,500万個の細胞を目標密度で500 x gで5分間遠心分離し、CypKを含む発現培地で再懸濁し、DNA-トランスフェクション試薬混合物を添加します。CypKは、以前に報告されたように購入または合成することができます。
   7. 細胞を20時間インキュベートした後、キットに含まれているトランスフェクション試薬エンハンサー250μLを加えます。
   8. CypK添加後6-7日後に上清から抗体を採取します(発現中に培地を交換する必要はありません).
      *あるいは、より高く、より一貫した収量を得るために、Oller-Salvia et al. 2018に記載されているように、安定した細胞株を作製することができます。この場合、トラスツズマブ(CypK)₂は、発現培地にCypK 5 mMを添加するだけで発現します。
2. 抗体を精製する
   1. 細胞を3000 x gで15分間遠心分離します。
   2. 0.45または0.22μmのフィルターで上清をろ過します。フィルターが隠れてしまった場合は、新しいフィルターに交換してフィルタリングを続行します。これがわずか数ミリリットル後に発生する場合は、上清を7000 x gでさらに15分間遠心分離します。
   3. 空のポリプロピレンクロマトグラフィーカラムにプロテインAレジン(2 mL/100 mLの上清)を加え、少なくとも5容量のビーズ洗浄バッファー(0.1 Mリン酸ナトリウム、150 mM NaCl)でレジンを平衡化します。
   4. 上清を2本の50 mLコニカルチューブに分割し、5倍ビーズ洗浄バッファー(0.5 Mリン酸ナトリウム、150 mM NaCl)を加え、続いてあらかじめ平衡化したプロテインA樹脂を加えます。コニカルチューブをローラーに室温で3時間置き、上清中の抗体を引き下げます。
   5. あるいは、推奨量の2倍以上の樹脂をカラムに上清を加え、流れるようにしてください。SDS-PAGEにより、上清に大量の抗体が残っていないことを確認します。ある場合は、上清を再び樹脂から溶出します。
   6. プロテインA樹脂と上清をカラムに移し、液体を流します。
   7. 25 mLの洗浄バッファー(または少なくとも10個のレジン量)を加え、フロースルーさせます。
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   8. mLの1 Mリン酸緩衝液(150 mM NaCl)に、4 mLの0.1 Mクエン酸ナトリウム(pH 3)で抗体を溶出します。
   9. 抗体を10mLのPBSで希釈し、遠心ろ過により0.5-1mLに濃縮し、緩衝液をPBSと3回交換します。
   10. 高塩緩衝液(1.5 M (NH4)₂SO₄、50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0、50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0、50 mM リン酸ナトリウム pH 7.0、5% イソプロパノール)に 30 分間、0.5 mL/分の流量と 0-100% グラジエントのブチル HIC カラムを使用して FPLC でサンプルを精製します。すべてのフラクションを回収し、280 nmでの溶出をモニターします。少量(< 1 mg)を2.4で説明した条件下でHPLC-HICで精製し、収量と純度を最大化できます。
   11. 抗体を含む画分をプールし、PBSで少なくとも4mLに希釈し、遠心ろ過で濃縮し、PBSとバッファーを3回交換します。
3. 抗体の定量
   1. 微量分光光度計を使用して280nmの吸光度を測定することにより、おおよその濃度を取得します。
   2. 正確な測定が必要な場合は、ELISAキットを使用してヒトIgGを測定してください。大まかな見積もりとしては、次のように SDS-PAGE を Coomassie ベースの染色とともに使用します。
      1. ELISAで定量したトラスツズマブ標準試料を1 mg/mLで2倍に6倍希釈して、標準試料を調製します。
      2. 標準試料とサンプルを約0.25 mg/mLで煮沸し、ローディングバッファーを減らします。
      3. MES-SDSバッファーを使用して4-12% Bis-Tris SDS-PAGEで分析し、Coomassieベースの色素で染色します。最後に、ImageJを使用して光または重いチェーンに対応するバンドの色密度を測定し、サンプルから信号を標準曲線で補間します。
4. 抗体は4°Cで保存してください。

2. 抗体を標識し、ADCの特性評価を行う

1. 抗体をテトラジン含有分子と結合させます
   1. テトラジン-vcMMAE (4 μL、3.4 mM in dimethyl sulfoxide(DMSO)) の 10 モル当量を、20 μL のアセトニトリルと 76 μL の PBS で小さな円錐形チューブ (PCR チューブなど) で希釈します。
   2. トラスツズマブ(CypK)₂(100 μL、PBS中2 mg / mL)と1モル相当量を加え、十分に混合し、室温(25 °C)で3時間反応させてトラスツズマブ(MMAE)₂.
      手記：このプロトコールを使用して、テトラジン-vcMMAEの代わりにテトラジン-5-TAMRAなどの他の分子を抗体にリンクさせることができます。
2. ADCを精製します
   1. サイズ排除スピンカラムをPBSで事前に平衡化します。メーカーの指示に従ってください。
   2. 反応の全容量をスピンカラムに加え、1500 x gで1分間遠心分離します。
3. ADCの定量化とSDS-PAGEによるコンジュゲートの解析
   1. 1.3.2.で説明されているように、標準曲線の非修飾抗体を使用してSDS-PAGE上の軽鎖の色密度を測定することにより、ADCを定量します。
   2. 重鎖はわずかにシフトし、結合時に分子量が増加しているはずです.
      注:抗体をトラスツズマブ(TAMRA)₂などの蛍光色素で修飾した場合、重鎖に対応するバンドのみが染色前にゲル内蛍光を示す必要があります。
4. HPLC-HICによる標識の分析
   1. HPLC-HICカラムを100%バッファーA(1.5 M(NH₄)₂SO₄、50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0、5%イソプロパノール)で5分間平衡化します。
   2. トラスツズマブ(CypK)2の1 mg/mL溶液15 μL(67 pmol)とバイアル中の2倍バッファーA15 μLを混合します。次に、HPLCで10 μLの注入をプログラムします。
   3. 100% バッファー A で 1 分間アイソクラティックな 1 mL/分流で溶出し、続いてバッファー A の 100 から 0% の B (50 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0、20% イソプロパノール) 中の 15 分間のグラジエントを行います。280 nmでの溶出をモニターします。
   4. DARを計算するには、各種に対応するピークを積分し、結果の面積を次の式で使用します:
      DAR = (1x トラスツズマブ(MMAE) + 2x トラスツズマブ(MMAE)₂)
      /(トラスツズマブ(MMAE)₀ + トラスツズマブ(MMAE)₁ + トラスツズマブ(MMAE)₂)
      トラスツズマブ(CypK)₂の予想保持時間は7.5〜8.0分、トラスツズマブ(CypK、MMAE)は9.1〜9.6分、トラスツズマブ(MMAE)₂は10.5〜11.0分です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エクスピ293F	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A14527 (英語)	HEK懸濁液セル
Expi293 エクスプレッション メディウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1435101	発現媒体
抗生物質-抗真菌薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15240062	ペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシンB
125mLポリカーボネート製三角フラスコ(ベントキャップ付き	コーニング	431143	シェイクフラスコ
ブランズウィックS41iインキュベーター	エッペンドルフ	S41I230011	シェーカー付きCO2インキュベーター
水酸化ナトリウム 4 mol/l (4 N) 水溶液中	VWRの	191373M 閲覧数
シクロプロペンリジン	シケム	SC-8017	この研究では、Elliot et al. 2014 で説明されているように合成されました。
Steriflip-GP、0.22 μm、ポリエーテルスルホン、ガンマ線照射	メルクミリポア	SCGP00525
Opti-MEM、低血清培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31985070	減量血清培地
ExpiFectamine 293 トランスフェクションキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A14525 (英語)	トランスフェクション試薬
5810 R遠心分離機	エッペンドルフ	5811000460
Millex-GPシリンジフィルターユニット、0.22 μm、ポリエーテルスルホン、33 mm、ガンマ線滅菌済み	メルクミリポア	SLGP033RS
プロテインA樹脂	シノバイオロジカル	10600-P07E-RN-25
ポリ分取クロマトグラフィーカラム、50 個入り	バイオ・ラッド	7311550	ポリプロピレンクロマトグラフィーカラム
エコノコラムファネル	バイオ・ラッド	7310003
クエン酸ナトリウム	フルーカ	71635
ÄKTA explorer FPLC	GEヘルスケア
HiTrap HICセレクションキット	GEヘルスケア	28-4110-07	HiTrap 1 mL ブチル HP を含む
硫安	VWRの	2133.296
イソプロパノール	ホニーウェル	34863-2.5L
ジメチルスルホキシド	シグマ・アルドリッチ	D8418-50ミリリットル
テトラジン-vcMMAE	ケムパートナー	-	合成されたコスチューム
テトラジン-5-TAMRA	イエナバイオサイエンス	CLK-017から05
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 ウェル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0321BOX
Xcell SureLockミニセル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EI0001
UltiMate 3000 HPLC	サーモフィッシャーサイエンティフィック
Thermo Scientific MAbPac、HIC-20、4.6 x 100 mm、5 μm	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88553
ナノアクイティ	水
ヒト血清	シグマ・アルドリッチ	H4522-20mL
CO2インキュベーター	パナソニック
モノメチルオーリスタチンE	ケイマンケミカル	16267
ナノドロップ 2000	サーモフィッシャーサイエンティフィック		マイクロボリューム分光光度計
インタントブルー	エクスペデオン	ISB1L(アイビー1L)	クマシーベースのステイン
チューブ 50 mL、114x28mm、PP	ザルシュテット	62.547.254	円錐管
アミコンウルトラ15遠心フィルターユニット50,000 NMWL	メルク	UFC905024	遠心ろ過濃縮器(プロテインAプルダウン後)
Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット 50,000 NMWL	メルク	UFC805024	遠心ろ過濃縮器(FPLCまたはHPLC精製後)
Zeba スピン脱塩カラム、7K MWCO、0.5 mL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	89882	サイズ除外スピンカラム
チューブPCR 0.2mlフラットキャップ	シスルサイエンティフィック株式会社	AX-PCR-02-C-CS	PCRチューブ

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