蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー:界面活性剤の可溶化に伴う蛍光膜タンパク質の完全性を同定する技術

要約

出典:Bird, L. E., et al. 大腸菌における膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニング。J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオでは、界面活性剤可溶化後の大腸菌における緑色蛍光タンパク質(GFP)融合膜タンパク質の安定性をスクリーニングするための蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー技術を示しています。サイズ排除プロファイルで対称的なピークを示し、遊離GFPがほとんどまたはまったくないタンパク質は、分解と凝集が最小限に抑えられた精製タンパク質を示しており、その後、構造機能解析のために選択できます。

プロトコル

1.膜分画の可溶化と分析

1. メンブレンフラクションを解凍し(必要な場合)、可溶化に使用する各界面活性剤について、メンブレン懸濁液900μlを1.5 mLのポリアロマー微量遠心チューブに分注します。
2. 調製したばかりの界面活性剤 (DDM、DM、Cymal-6、LDAOの10%w/v溶液) 100 μlを、最終濃度1%まで、指定の1.5 mLチューブに加えます。真核生物の膜タンパク質の可溶化のために、ヘミスコハク酸コレステロール(最終濃度0.2%)を界面活性剤に添加することができます。
3. 混合物を4°Cで1時間、穏やかに攪拌しながらインキュベー
トします。
4. 界面活性剤不溶性画分をベンチトップ超遠心分離機でペレット化し、チューブが少なくとも半分満たされていることを確認し、4°Cで150,000 gで45分間、上清を保持します
   手記：界面活性剤の可溶化の有効性は、蛍光プレートリーダーを使用して、同量のPBSに再懸濁した界面活性剤不溶性画分を用いた可溶化膜のGFP蛍光を測定することで推定できます。
5. さまざまな界面活性剤である膜タンパク質複合体の単分散性を、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)を使用して解析します。
6. FSEC 分析では、分子量 5,000 から 5,000,000 の分子量など、分画範囲が広いサイズ排除カラムを、流速 0.3 ml/分のランニングバッファー (20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、0.03% DDM) で平衡化します。このバッファーは、すべてのサンプルに使用します。つまり、テストする界面活性剤ごとに変更する必要はありません。
7. 100 μl の可溶化メンブレンを 0.3 ml/分の流速でカラムに注入し、蛍光光学系 (488 nm での励起と 512 nm での発光) を使用して溶出プロファイルをモニターします。インライン蛍光モニターが利用できない場合は、フラクションを収集し、プレートリーダーで蛍光を読み取ります。
8. 溶出量と蛍光強度のデータをスプレッドシートプログラムにインポートして、グラフィカルに表示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コレステロールヘミスコハク酸	シグマ・アルドリッチ	C6512
CYMAL-6(6-シクロヘキシル-1-ヘキシル-βD-マルトシド)	アナトレース	C326
DDM(n-ドデシルβ-マルトシド)	ジェネロン	D97002
DM(n-デシルβ-マルトシド)	ジェネロン	D99003
LDAO(N,N-ジメチル-ンドデシルアミンN-オキシド)	ジェネロン	D71111
BenchMark 蛍光タンパク質標準試料	ライフテクノロジー	LC5928
Optima L-100 超遠心分離機 45-Ti ローター	ベックマン・コールター	393253
TLA-55ローターを実行するOptima Max-XP超遠心分離機	ベックマン・コールター	393315
RF-20A蛍光検出器を搭載したプロミネンスUFLC	島津製作
セファロース 6 10/300 GL サイズ除外列	GEヘルスケア	17-5172-01