DFEベースのアフィニティークロマトグラフィー:高イオン強度ベースの溶出条件を使用して粗サンプルから2F5モノクローナル抗体を精製する技術

Abstract

出典:Knödler, M. et al., Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study.J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、DsRed-2F5-EpitopeまたはDFEリガンドを使用して2F5モノクローナル抗体を精製するためのアフィニティークロマトグラフィー技術について説明しています。精製された2F5モノクローナル抗体は、免疫療法に不可欠な薬剤です。

Protocol

1. 清澄化された植物抽出物からのmAbsの精製試験

1. 2F55を含有する清澄植物抽出物100mL、または2F5を含有する好ましい細胞ベースの発現系からの上清を調製します。
2. 平衡化バッファー(20 mM リン酸ナトリウム、500 mM 塩化ナトリウム、pH 7.4)、低 pH 溶出バッファー(0.05 M クエン酸、0.05 M 塩化ナトリウム、pH 4.0–3.25)、および高イオン強度溶出バッファー(1.0–4.0 M 塩化マグネシウム、0.1 M HEPES、pH 8.0)を調製します。
3. クロマトグラフィーシステムをバッファーで洗い流します。DFEアフィニティーカラム(メインプロトコールテキストを参照)をクロマトグラフィーシステムに取り付け、5 CVの平衡緩衝液で1.0 mL ^min-1の流速で平衡化します。280 nm.
   での UV 吸光度をモニタリングします。 手記： 植物抽出物や細胞培養上清をカラムにロードすると、背圧が上昇する可能性があります。クロマトグラフィーシステムやDFEカラムの損傷を避けるために、高圧アラートを0.2 MPaに設定します。
4. 清澄化された植物抽出物または上清80 mL(ステップ1.1)を0.5 mL min-1の流速でカラムにロードし、2分間の接触時間を保証します。フロースルーサンプルは、すぐにサンプル分析が不可能な場合は4°Cで保存してください。
5. カラムを6 CVの平衡緩衝液で洗浄します。このステップの開始、中間、および終了時に洗浄のサンプルを収集します。
6. 5 CV の低 pH 溶出バッファーまたは高イオン強度溶出バッファー (0.1 M HEPES、1.25 M 塩化マグネシウム、pH 8.0) を含む mAb 2F5 溶出。UV 280 nm 信号がベースラインより 5 mAU 高い位置に増加したら、DFE フラクションを収集します。
   1. 各エピトープ-抗体ペアの溶出バッファーを最適化します。2F5の場合、1.25 M塩化マグネシウムは、生成物の回収率とリガンドの安定性との間の最適なバランスを達成しました
      手記： 塩化マグネシウム溶液は沈殿しやすいです。したがって、塩化マグネシウムを~700mLの水に溶解します。HEPESを100mLの水に別々に溶解し、pHを8.0に調整します。溶解した塩化マグネシウム溶液をHEPES溶液に加え、最終容量1.0Lまで水を加えます。塩化マグネシウムを溶解した後は、沈殿の原因となりますので、pHを調整しないでください。
7. ステップ1.4〜1.6で採取したすべてのサンプルを、ブラッドフォード法、ドデシル硫酸リチウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(LDSPAGE)、および表面プラズモン共鳴(SPR)分光法を使用して分析します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dsレッド	フラウンホーフェIME	該当なし	スタンダート
HiTrap NHS活性化セファロースHP、1 mL	GEヘルスケア	17-0716-01	クロマトグラフィーカラム
ヘープス	カール・ロスGmbH	9105.3	バッファコンポーネント
塩化マグネシウム	カール・ロスGmbH	KK36.2	バッファコンポーネント
PHの3110	WTWの	2AA110	pHメーター
セファデックスG-25ファイン、架橋デキストラン	GEヘルスケア	17003301	クロマトグラフィー樹脂
塩化ナトリウム	カール・ロスGmbH	P029.2	バッファコンポーネント
クエン酸ナトリウム	カール・ロスGmbH	HN13.2	バッファコンポーネント