薄層クロマトグラフィーに基づく酵素活性アッセイ:薄層クロマトグラフィーを使用してin vitroピロホスホキナーゼ活性を決定する技術

要約

出典:Pokhrel, A., et al.クロストリジウム・ディフィシル由来の(p)ppGpp合成酵素に対する精製およびIn Vitro活性アッセイ。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、放射性標識ヌクレオチドを使用してピロホスホキナーゼ活性を測定するための薄層クロマトグラフィーベースの酵素アッセイを示しています。この分析法は、ヌクレオチド合成およびリン酸化転写反応に関する知見を提供します。

プロトコル

1. 薄層クロマトグラフィーによるタンパク質活性アッセイ

1. 薄層クロマトグラフィー(TLC)プレートを調製します。
   1. ポリエチレンイミン(PEI)-セルロースプレートを脱イオン水で洗浄して調製します。プレートを二重蒸留水を入れたガラスチャンバーに~0.5cmの深さまで置きます。
   2. プレートの上部に水が移動するのを待ちます.
      注:プレートを洗浄しなくてもプレートを使用できるため、プレートの洗浄は厳密には必要ありませんが、洗浄すると結果の画像の鮮明さが向上します。プレートを2つの垂直方向に洗浄すると、レジンに存在する汚染物質がプレートの1つのコーナーでさらに分離されます(図1)。
   3. プレートをガラスチャンバーから取り出し、ベンチトップラックに置いて一晩(12〜18時間)乾燥させます。
   4. ドライプレートの一方の端から2.0cmのところに柔らかい鉛筆で印を付け、サンプルがTLCに適用される場所を示します。2 μLのサンプルの場合、サンプルを1.0 cm以上離して適用します(図1).
      注:これにより、隣接するスポット間の明確な分離が可能になり、これは信号の定量化に重要です。セルロース樹脂に傷がついていない限り、表面の小さな鉛筆の跡が溶剤の移動を妨げることはありません。
   5. 実験を計画するときは、常に各プレートの1つのスポットを未使用のままにしてください.
      注:これにより、サンプル定量用の空白レーンが提供されます(図1)。20cmのTLCプレートには19個のスポットを収納できます。
2. 酵素活性アッセイ
   1. 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、25 mM 酢酸アンモニウム、10 mM KCl、1 mM DTT、0.6 mM ATP(アデノシン三リン酸)を含む5倍バッファーミックスを調製します< / > 注:この混合物は、大量に調製し、後で使用するために10μLのアリコートで凍結することができます。混合物を複数回の凍結融解サイクルにさらさないでください。
   2. 3 μM RSH(Rel/Spoホモログ酵素)、1xバッファーミックス、0.6 mM GDP(グアノシン二リン酸)、1.2 mM MgCl₂を含む個々の反応液を調製します。反応10μLあたり1.0μCiの^γ-32P-ATP(放射性標識ATP)を添加し、ヌクレアーゼを含まない水を使用して反応を目的の容量にします。ヌクレオチド含有混合物にRSHを添加すると酵素活性アッセイが開始されるため、他の成分を混合した後にRSHを添加します
      注:最終的な反応量は、サンプリングされたタイムポイントの数によって異なります。2 μL/タイムポイントをサンプリングするには、4つのタイムポイントごとに10 μLの反応混合物を組み立てます。
   3. ヌクレアーゼ活性の汚染によるATP加水分解を制御するには、タンパク質を含まない10 μLの反応液を組み立て、並行してインキュベートします。t = 0 の時点で 2 μL のサンプルをスポットし、実験の最後に、タンパク質の非存在下で ATP が加水分解されていないことを確認します。
   4. RSHを添加した直後に、2 μLを取り出し、ラベル付けされたPEI-セルロースプレート上にt = 0分サンプルとしてスポットします。
   5. 反応液を37°Cでインキュベートし、所望の時点で2μLのアリコートを除去します><。 注:サンプルがセルロースプレートに吸着すると、酵素活性は停止します。最後のスポットをプレートに追加してから10〜30分待ってから、完全な吸着とサンプルの乾燥を確保します。
3. 薄層クロマトグラフィー
   1. クロマトグラフィーチャンバーに 1.5 M 1.5 M KH₂PO₄ (pH 3.64) を 0.5 cm.
      まで充填します。 注:必要な容量は、クロマトグラフィータンクの寸法によって異なります。TLCプレートを曲げずに挿入できる幅の水平底を持つガラス容器は、カバーを追加することで現像タンクとして使用できます。TLCプレートは、きれいなカミソリの刃でより細いストリップにカットすることができ、プラスチックフィルムで覆われたガラスビーカーでの現像を可能にします。
   2. プレートの下端を溶剤に浸します。溶媒がプレートの上部に移動するのを待ちます(~90分).
      注:溶媒の移行はプレートの上部で停止し、長時間の浸漬中にサンプルが失われたり一緒に流れたりすることはありませんが、プレートを一晩溶媒に放置しないでください。4時間を超える浸漬は、レジンがプレートの裏地から剥がれ、シグナルが失われる原因となる可能性があります。
   3. プレートをクロマトグラフィータンクから取り出し、ベンチトップ乾燥ラックに置きます。
   4. プレートを一晩風乾させます.
      注:ヘアドライヤーを使用して乾燥を促進することができます。乾燥度は樹脂の色で評価でき、濡れると黒ずみ、完全に乾くと未使用のプレートの色に戻ります。
   5. プレートが乾いたら、放射性物質がイメージングカセットに移らないようにプレートをプラスチックフィルムで包み、オートラジオグラフィーで分析します(図2)。
4. データ分析
   1. 分離した反応を含むPEIセルロースプレートを室温で4時間リン酸化鏡カセットにさらします
      注:これは、示された濃度の新鮮な^γ-32P-ATPを使用して非常に鮮明な画像を生成するのに十分な露光です。より少ない量の放射性標識基質を使用する場合、曝露時間を12〜16時間に増やすことができます。
   2. フォスフォイメージャーでカセットを画像化します。
   3. グラフィカルユーザーインターフェースを備えたイメージングソフトウェアを使用して、Draw Rectangleを選択し、マウスを使用して1つのレーン全体とそのレーンに含まれるATPおよびppGpp(グアノシン四リン酸)スポットの周囲に長方形のROIを描画することにより、関心領域(ROI)を描画します(図2)。
   4. [Select]、[Copy]、および [Paste] コマンド (または、使用されているイメージング ソフトウェアに基づく対応するコマンド) を使用して、他のレーン内に同一の ROI を描画し、ROI が各レーンの同一領域内で信号を測定していることを確認します。未使用のレーンからの ROI を含め、空白として使用します。
   5. Analyze |ツール |ROIマネージャー |イメージングソフトウェアのコマンドを追加し、PEIセルロースプレートに描画されたすべてのROIを選択します。
   6. Analyze |測定値の設定 |測定コマンドを実行し、各ROI内の信号強度を定量化し、測定値をスプレッドシートとしてエクスポートします(図2)。実験信号から空白の ROI 値を減算します.
      
   7. 各レーン内のブランク信号の何パーセントがATPとppGppに起因するかを、次の式を使用して計算します。
      注:ROIは、フォスフォイメージャーと互換性のある商用ソフトウェアまたは無料で入手できるImageJソフトウェア(National Institutes of Health)を使用して描画および定量化できます。

結果

図1:TLCプレートの調製。(A)プレートは、下端を水(青)に置くことにより、一次元で洗浄されます。汚染物質(黄色)は、溶媒とともにプレートの上部に移動します。(B)プレートが完全に乾燥した後、プレートを最初の洗浄に対して90°回転させ、再び水がプレートの上部に移動するようにして、2次元で洗浄します。(C)洗浄後、汚れはプレートの1つのコーナーに分離されます。洗浄したTLCプレートの樹脂には、柔らかい鉛筆で優しく印を付けて、サンプルを採取する場所を示すことができます。2 μLのサンプルの場合、スポット間の間隔が1 cm以上あると、適切なサンプル分離が保証されます。サンプルは、プレートの「底」から2cmのところに発見されます。サンプルの塗布後、溶媒は「上部」まで流れ込み、そこで汚染物質は水洗浄によって分離されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
薄層クロマトグラフ(TLC)現像タンク	一般的なガラス吹き会社	80から3
ポリエチレンイミン(PEI)-セルロースプレート(20cm×20cm、厚さ100μm)、ポリエステル支持体付き	シグマ・アルドリッチ	Z122882-25EA
ATP、[γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml リード、100 μCi	パーキン・エルマー	NEG002A
アデノシン 5'-三リン酸 (ATP) 100 mM	バイオベーシックカナダ	AB0311
グアノシン-5'-二リン酸二ナトリウム塩(GDP)	アルファ・アエサル	AAJ61646MC/E
貯蔵用蛍光体スクリーン	GEヘルスケアライフサイエンス	BAS-IP TR 2040 E トリチウムスクリーン
Storm 860 フォスフォイメージャー	GEヘルスケアライフサイエンス	-