高性能薄層クロマトグラフィー:好中球からの脂質の予備的分離および定量のための技術

Abstract

出典:Brogden, G., et al. 好中球の脂質変化とその後の好中球細胞外トラップの形成を研究する方法。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、ヒト末梢血由来好中球から脂質を予備的に分離し、定量化する技術を示しています。この手法は、HPLCに進む前にターゲット分析種の初期評価を行うのに役立ちます。

Protocol

1. コレステロール、リン脂質、スフィンゴミエリンなど、いくつかの脂質の量を半定量化する高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)

1. 以下の4つのランニング溶液と染色溶液を調製します。
   1. 溶液1:酢酸エチル(26.6%)、1-プロパノール(26.6%)、クロロホルム(26.6%)、メタノール(26.6%)、塩化カリウム(9.6%)を混合します。0.25 gのKClを100 mLのHPLC品質の水に溶解してKClを調製します。
   2. 解決策2:n-ヘキサン(73%)、ジエチルエーテル(23%)、クエン酸(2%)を混合します。
   3. 解決策3:100%n-ヘキサン。
   4. 蒸留水(90mL)と硫酸銅7.5gを混合して染色液を調製し、リン酸10mLを加えます。
2. 各溶液を別々のガラスチャンバーに最大5 mm充填します。各チャンバーの走行速度を上げるために、あらゆる種類の濾紙を追加します。
3. 20 x 10 cm HPTLC シリカゲル 60 ガラスプレートを最初のランニング溶液にプレインキュベートし、ランニング溶液がプレートの上部に到達するまでインキュベートします。その後、110°Cで10分間乾燥させます
   手記：これらのプレートは、将来の使用のためにアルミホイルで保存し、使用前に110°Cで10分間乾燥させることができます。
4. ヒト末梢血由来好中球から得られた脂質ペレットを200 μLのクロロホルム/メタノール(1:1)溶液に溶解し、37°Cで15分間インキュベートして溶解します。
5. 定規と柔らかい鉛筆を使用して、必要なサンプル数と少なくとも1つの標準試料のローディングスポットをマークします。走行距離を、1 回目と 2 回目のランニング ソリューションでそれぞれ約 4 cm と 6 cm にマークします。
6. サンプルをロードするには、新しいサンプルをロードする前に、10 μLシリンジをクロロホルム/メタノール(1:1)で3回洗浄します。各サンプルを10μL滴下し、サンプルをできるだけ小さな領域に集中させようとします。サンプルは少なくとも重複してロードする必要があります。
7. 溶液1を実行中の溶液(ステップ1.1.1)でプレートを最初のチャンバーに垂直に置きます。プレートがガラスチャンバーの壁と平行になっていることを確認して、均一な移動速度を実現します。
8. 溶媒ラインが最初のマークに達したら、プレートを取り外して乾燥させ、2番目の溶液に入れます。2 番目と 3 番目の実行中のソリューションについても、同様の手順を繰り返します。溶媒の前面がプレートの上部に達するまでプレートを溶液中に置いてから、取り出してRTで1分間乾燥させます。
9. プレートを硫酸銅溶液に7秒間置き、プレートを取り外し、完全に乾燥させ、オーブンで170°Cで7分間焼きます。
10. 薄層クロマトグラフィーおよびゲル分析ソフトウェア、および画像処理ソフトウェアを使用して、スキャンおよび分析を行い、分離された脂質のバンドを特定します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-プロパノール	シグマ・アルドリッチ	33538
10 μL シリンジ	ハミルトン	701 NR 10 μl
ジエチルエーテル	シグマ・アルドリッチ	346136
酢酸エチル	カール・ロス	7336.2
銅(II)硫酸五水和物	メルク	1027805000
クロロホルム	カール・ロス	7331.1
CP ATLASソフトウェア	Lazarソフトウェア	2
メタノール	カール・ロス	7342.1
n-ヘキサン	カール・ロス	7339.1
燐酸	シグマ・アルドリッチ	30417
塩化カリウム	メルク	49,361,000
HPTLCシリカゲル60	メルク	105553